Tehnologija inaktivacije i uklanjanja virusa krvnih produkata

Krvni proizvodi su "komponente proteina plazme ili komponente krvnih zrnaca, kao što su albumin ljudske krvi, ljudski imunoglobulin, ljudski faktor koagulacije (prirodni ili rekombinantni) koncentrat crvenih krvnih zrnaca, itd., odvojeni od zdrave ljudske plazme ili plazme osobe sa imunitetom, pročišćeni ili napravljene tehnologijom rekombinantne DNK, za dijagnostiku, terapiju ili pasivnu imunoprofilaksiju". Krvni proizvodi imaju važnu ulogu u hitnoj medicinskoj pomoći, spašavanju ratnih ozljeda i prevenciji i liječenju nekih specifičnih bolesti.

 

Regulatorna pozadina

Prakse osiguranja sigurnosti moraju osigurati da je konačni lijek siguran za regulatore i, na kraju, za pacijente i javnost. Tokom 1990-ih, Međunarodna koordinaciona konferencija (ICH 1998) izdala je "Q5A: Procjena virusne sigurnosti biotehnoloških proizvoda ćelijskih linija ljudskog ili životinjskog porijekla" (Q5A: Procjena virusne sigurnosti), uspostavljajući svjetski standard za virusnu sigurnost.

ICH Q5A opisuje višeslojnu šemu za testiranje i provjeru valjanosti za postizanje ovog cilja. Program testiranja fokusira se na banku ćelija, prikupljanje sirovina i bioreaktora, dopunjeno analizom rizika proizvoda. Pored testiranja, ICH Q5A zahtijeva da se nizvodna dekontaminacija ocijeni kao mjera bezbjednosti kada se uzvodno ne otkriju zagađivači. Provjera odobrenja osigurava da, ako bilo koji virus izbjegne režim testiranja, može biti uklonjen i/ili inaktiviran prije nego što završi u konačnom lijeku.

 

Pozadina cjelokupnog programa zaštite od virusa

U modernoj biotehnološkoj proizvodnji (ili bioprocesiranju), obično postoje tri ili četiri jedinice operacije u cijeloj pročišćenoj sekvenci, koje mogu ukloniti ili inaktivirati virus. Ovo uključuje određene hromatografske korake (kao što je protein A ili anionska izmjena), kulturu niske pH vrijednosti ili deterdženata i filtere za zadržavanje virusa. Neće svi od ovih koraka efikasno ukloniti ili deaktivirati sve viruse.

Na primjer, kultura niskog pH obično je neefikasna za inaktivaciju virusa bez omotača, ali dobro funkcionira za inaktivaciju virusa s omotačem. Pod određenim radnim uslovima, kolona za anionsku izmjenu možda neće moći vezati i ukloniti neutralne izoelektrične viruse iz toka proizvoda, ali je učinkovita protiv kiselih virusa.

To je kombinacija tri do četiri nezavisne i ortogonalne jedinice koje zajedno osiguravaju sigurnost biotehnoloških proizvoda od virusa.

 

Općenito se pretpostavlja da će robustan, efikasan i pouzdan korak obrade moći ukloniti ili deaktivirati veliki broj virusa (obično definiran kao 4 log10 ili više, gdje se vrijednost smanjenja ili LRV izračunava kao log10 ukupnog broja virusa). broj virusa na ulazu podijeljen s ukupnim brojem virusa na izlazu). Međutim, LRV se ne može koristiti kao jedinstvena apsolutna mjera efikasnosti koraka. Podaci mogu biti preliminarni. Lako ga je modelirati, relativno je neosjetljiv na promjene u uslovima procesa i efikasan protiv niza virusa (WHO 2004).

Virusna filtracija je široko priznata kao snažan i efikasan korak u procesu i ključna je komponenta ukupne strategije za minimiziranje rizika od egzogenih i endogenih virusnih čestica tokom proizvodnje biotehnoloških proizvoda.

Virusni filteri često rade kroz jake mehanizme zadržavanja zasnovane na veličini. Na osnovu ovog snažnog mehanizma djelovanja, virusni filteri su vjerojatnije nego hromatografski koraci da osiguraju predvidljivo zadržavanje virusa za niz virusa. To je zato što je manje vjerovatno da će na filter utjecati razlike u fizičko-hemijskim svojstvima različitih virusa i interakcije virus-smola regulirane radnim uvjetima. Stoga se korak virusne filtracije obično koristi u dobro osmišljenim rekombinantnim terapijskim procesima prečišćavanja proteina (EMEA 1996), za koje se također pokazalo da imaju robusne performanse u industriji obrade plazme.

 

Međutim, krvni proizvodi su poput mača sa dvije oštrice, koji ne samo da spašava hiljade života, već ima i mogućnost širenja bolesti i ugrožavanja zdravlja ljudi. Prema statističkim podacima, od 1977. do 1984. godine, najmanje 30,000 primalaca krvi u Sjedinjenim Državama primilo je krv zaraženu virusom AIDS-a. 1985. godine, 1.200 od 3,000 hemofiličara u Francuskoj je zaraženo AIDS-om putem transfuzije krvi ili krvnih proizvoda.

Prema Svjetskoj zdravstvenoj organizaciji, 5% do 10% infekcija AIDS-om u svijetu uzrokovano je transfuzijama krvi ili krvnih proizvoda zaraženih AIDS-om. Prvi slučaj AIDS-a u Kini zaražen je upotrebom uvezenih krvnih proizvoda zaraženih virusom AIDS-a. Osim toga, zabilježen je i prijenos bolesti hepatitisa B i C uslijed transfuzije krvi i krvnih produkata.

 

1. Glavni virusi koji se prenose krvnim proizvodima i njihove karakteristike

Postoje mnoge vrste virusa koji se prenose krvlju i krvnim proizvodima, kao što je prikazano u Tabeli 1. Među njima, HIV, HBV i HCV su zabrinuti u domaćim i stranim medicinskim krugovima zbog njihove visoke stope infekcije i ozbiljne štete.

Budući da krv i krvni proizvodi imaju mogućnost širenja virusa, to je ozbiljno uticalo na njenu primjenu u prevenciji i liječenju bolesti. Stoga se u proizvodnji krvnih proizvoda moraju dodati procesi inaktivacije i uklanjanja virusa kako bi se osigurala sigurnost krvnih proizvoda.

2. Glavne metode inaktivacije i uklanjanja virusa

Kako bi se osigurala sigurnost krvnih pripravaka, pored odabira davalaca krvi, imunizacije gdje je to moguće, te striktnog testiranja prikupljene krvi i drugih mjera, inaktivacija i uklanjanje virusnog tretmana krvnih produkata važna je karika za osiguranje sigurnost transfuzije krvi. Nekoliko često korištenih i učinkovitih metoda za inaktivaciju i uklanjanje virusa detaljno je opisano u nastavku.

 

I. Metode inaktivacije virusa

1. Pasteurova metoda

Teorijska osnova ove metode je da je brzina uništavanja strukture virusa mnogo veća od one strukture proteina kroz odabir temperature i vremena djelovanja. Gotovo 50 godina kliničkih rezultata i nedavnih eksperimenata na životinjama potvrdili su da albumin u otopini nakon 60 stupnjeva, 10 h zagrijavanja, odnosno Pasteurove dezinfekcije, može ne samo inaktivirati HBV, već i inaktivirati HCV i HIV, što albumin čini najpouzdanijim. krvni proizvod u virusnoj sigurnosti.

Nedavno je Pasteurov proces proširen na proizvodnju IVIG, FVI, FIX, fibrinogena i drugih proizvoda. Bridonnccu et al. je ovaj proces inaktivacije virusa dodao IVIG procesu proizvodnje etanola na niskoj temperaturi, odnosno Pasteurova metoda je implementirana u uvjetima bez stabilizatora, niske soli i kiselosti, a titar virusa je smanjen za 5 Log. Simmonds et al. testirali transfuzijski prenosivi virus (TTV) koncentrovanih preparata FVⅢ i FIX koji se klinički koriste u UK-u i otkrili da je stopa otkrivanja TTV-a proizvoda bez inaktivacije Pasteur virusa bila 50% do 75%, a pozitivna stopa detekcije proizvoda nakon Pasteurove inaktivacije bio je 0.

Pozitivna stopa na TTV bila je 27% kod 84 pacijenta s hemofilijom u Ujedinjenom Kraljevstvu koji su koristili neinaktivirane proizvode faktora zgrušavanja, dok je samo 1 od 19 pacijenata koji su koristili proizvode faktora zgrušavanja inaktiviranih virusom bio pozitivan, sa pozitivnom stopom otkrivanja od 5%. Stoga je proces inaktivacije virusa vrlo efikasan u poboljšanju sigurnosti krvnih proizvoda.

 

2. Organski rastvarač u kombinaciji sa surfaktantom (S/D metoda)

This method was first established by Horowitz et al., a blood center in New York, the principle is that organic solvents can make lipids fall off the surface of the virus, so that the structure of the virus is destroyed and the infection activity is lost. The common S/D method uses n-butyl triphosphate (TNBP) in combination with different surfactants such as Tine80, Triton X100, and sodium cholate. The effect of S/D method on the inactivation of lipid-coated viruses in blood products has been confirmed. For example, when FI concentrated preparations were treated with 0.3%TNBP and 0.2% sodium cholate at 24℃ for 6 h, the inactivation of HBV and HCV was >4 Log,HIV >4.5 Log, and the inactivation of VSV and Sindbis viruses was >4.5 Log, and the recovery rate of FVIII was >90%. Veliki broj krvnih produkata inaktiviranih S/D metodom dokazano je da su sigurni i pouzdani kroz dugotrajnu kliničku primjenu, pa se široko koriste. Međutim, ova metoda nema sposobnost inaktivacije protiv parvovirusa B19, HEV-a i drugih virusa koji nisu obloženi lipo.

 

3. Metoda inaktivacije suvom toplotom

Inaktivacija suhom toplinom znači da se liofilizirani preparat tretira zagrijavanjem, a virus ubija suhom toplinom. Najčešće korišćene metode suve toplote su 60 stepeni ~80 stepeni, 10~72 h metoda grejanja i 80 stepeni, 72 h tretmana. Već početkom 1980-ih bilo je korisno zagrijati FVIII liofilizirani koncentrovani preparat i protrombinski kompleks na 60° ~ 80° u trajanju od 10 ~ 72 h. Međutim, dokazano je da ova metoda ne može u potpunosti inaktivirati HBV, HCV, HIV. Termički tretman na 80 stepeni i 72 h pokazao se efikasnim u inaktivaciji HBV, HCV i HIV-a. Postoje i noviji izvještaji o liofiliziranim preparatima faktora koagulacije tretiranih na 100 stepeni. Xu Jinbo i saradnici su tretirali IgG na 100 stepeni tokom 30 minuta i inaktivirali virus vezikularnog stomatitisa 8.2 Log. Neki ljudi će zamrznuti sušeni FVIII na 68 stepeni tokom 72 sata, u suvom stanju, a zatim zagrejati na 100 stepeni 0,5 ~ 1 h. Ova metoda je relativno ekonomična.

 

4. Fotohemijska metoda

This method was first proposed by Matthews et al. The principle is that some photosensitizers have a strong affinity for the surface of the virus and the structure of the viral nucleic acid, and are easily activated under appropriate wavelength of light, thus destroying the structure of the virus in contact with them through photochemical action. The photosensitizers that have been used include: hemacoline derivatives, psoralide derivatives, phenothiazines, phthalocyanines, and cyanine 540, etc. The main feature of this method is that it can be used to inactivate the virus of whole plasma, and the inactivation of the virus of platelet products is the current research focus. Scientists from the Department of Experimental Medicine at the University of California in the United States have screened out a new psoralen derivative S-59 among more than 100 chemical modifications of psoralen. The platelets were irradiated with 150 um S-59 combined with 3 J/cm2 UVA, which could inactivate >6.7 Log of free HIV and >6.6 Log ćelija vezanih za HIV, a trombociti su ostali dobri nakon 7 dana funkcionalnog očuvanja in vitro, što je FDA odobrila za klinička ispitivanja.

Među ovim metodama, Pasteurova metoda dezinfekcije i S/D metoda su odobrene od strane FDA Sjedinjenih Država i široko se koriste u svijetu. Metoda inaktivacije suhom toplinom je uglavnom pogodna za virusnu inaktivaciju liofiliziranih preparata. Fotohemijska metoda ima snažan inaktivacijski učinak na viruse obložene lipidima, a korištena je u inaktivaciji virusa cijele plazme u Europi i ima široke izglede za inaktivaciju virusa u komponentama krvnih stanica. Međutim, sve ove metode imaju svoje nedostatke, kao što je Pasteurova sterilizacija nije idealna za inaktivaciju nekih virusa otpornih na toplinu; S/D metoda nije mogla efikasno inaktivirati virus koji nije obložen lipo. Fotohemijska metoda značajno je oštetila aktivnost nekih proteina plazme. Trenutna klinička upotreba naknadnih istraživanja pokazuje da nijedna metoda inaktivacije virusa ne može jamčiti da su krvni proizvodi apsolutno oslobođeni rizika od prijenosa virusa.

 

I. Proces uklanjanja virusa

U proizvodnji krvnih proizvoda, jedan proces inaktivacije ne može inaktivirati sve viruse; Osim toga, sam virus je heterologni protein, kao što je unos s proizvodom izazvati neželjene reakcije; Istovremeno, zbog ograničenosti tehničkog nivoa, još uvijek postoje virusi čije karakteristike nisu pronađene ili shvaćene, tako da postojeće metode inaktivacije virusa ne mogu garantirati inaktivacijski učinak ovih virusa. Stoga, sama inaktivacija ne može jamčiti sigurnost proizvoda i mora se ukloniti iz proizvoda. Dakle, tehnologija uklanjanja virusa dobija sve više pažnje. U nastavku su ukratko opisana dva najčešće korištena i efikasna procesa uklanjanja virusa.

1. Kromatografska tehnologija

Kromatografska tehnologija se odnosi na korištenje različitih komponenti i razlika afiniteta stacionarne faze ili interakcije, kako bi se postiglo razdvajanje različitih komponenti. Kao napredna tehnologija za proizvodnju krvnih proizvoda, sama hromatografija ima efekat uklanjanja virusa, posebno afinitetnu hromatografiju i hromatografiju ionske izmene. Za hromatografiju s ionskom izmjenom, eluiranje ima prednosti u odnosu na penetraciju u uklanjanju virusa. Tabela 2 prikazuje statistiku podataka o stopi uklanjanja HAV-a hromatografskom tehnologijom u procesu proizvodnje albumina od strane kompanije CSL u Australiji. Kao što se može videti iz tabele 2, jonoizmenjivačka hromatografija i gel filtracija su efikasniji u uklanjanju HAV-a, sa ukupnom stopom uklanjanja od 10,9 Log.

U proizvodnji FVIII, Baxter Healtheare izvodi imunoafinitetnu hromatografiju koristeći gelove tretirane anti-FVIII antitijelima, koji mogu ukloniti (4.2±0.1)Log i (5.3±0.9)Log iz ne -virusi obloženi lipidima kao što su PPV i HAV, respektivno.

 

2. Nanofilmska filtracija

Za neke viruse sa malim promjerom površine, kao što su HAV i parvovirus B19, nanomembranska filtracija je najefikasnija metoda uklanjanja. Koristi razliku u veličini između proteina i virusa i adsorpciju virusa od strane filterske membrane za izolaciju virusa. Na lokaciji Sanquin Blood Supply Site u Holandiji sprovedena je laboratorijska studija o uklanjanju virusa dodavanjem jednostepene, dvostepene Planova 15N nanomembranske filtracije u proces proizvodnje protrombinskog kompleksa. Utvrđeno je da su stope uklanjanja HIV-a, HAV-a i drugih virusa povećane u različitim stepenima nakon nanomembranske filtracije (vidi tabelu 3).

Međutim, mogu se pojaviti sljedeći problemi kada se ova metoda primjenjuje u industrijskoj proizvodnji: Prvo, zbog visokog viskoziteta proizvoda i prisustva proteina velikog promjera, veličina pora membrane odabrane filterom ne smije biti premala, čime se ograničava uklanjanje virusa malog promjera kao što je HCV; Drugo, stabilnost kontrole veličine pora na membrani u procesu proizvodnje filtera će uticati na uklanjanje virusa. Treće, kada je otvor membrane manji od prečnika virusne čestice blokiran, brzina protoka proizvoda će se smanjiti, što utiče na prinos. Stoga je odabir membrana čija svojstva i veličina pora odgovaraju potrebama prerađenih proizvoda važan faktor u tome da li nanomembranska filtracija može ukloniti viruse.

 

3. Diskusija

Pod pretpostavkom osiguranja kvaliteta izvora krvi, proces inaktivacije i uklanjanja virusa je važno i neophodno sredstvo za osiguranje sigurnosti krvnih proizvoda. Upotreba samo jednog inaktiviranog virusnog procesa ne može apsolutno garantirati sigurnost krvnih proizvoda. Na osnovu tehnologije inaktivacije virusa, dodana je tehnologija uklanjanja virusa kao što su hromatografija i nanofilmska filtracija, brzina uklanjanja virusa je značajno povećana, a efekat inaktivacije i uklanjanja virusa je značajno poboljšan. Trenutno je Evropa jasno predložila da se u procesu proizvodnje krvnih proizvoda mora koristiti barem jedna inaktivacija i uklanjanje virusa kako bi se osigurala sigurnost krvnih proizvoda.

U Kini većina proizvođača krvnih proizvoda koristi samo jedan inaktivirani virusni proces u procesu proizvodnje, kao što je Pasteurova metoda dezinfekcije, S/D metoda, itd., ali ne koristi proces uklanjanja virusa, što ozbiljno utječe na kvalitetu krvnih proizvoda. Ulaskom Kine u WTO, proizvodni proces i standardi kvaliteta domaćih krvnih proizvoda bit će u skladu sa svjetskim, inače ne može garantirati postojeći udio na domaćem tržištu, ali isto tako ne može konkurirati sličnim proizvodima u drugim zemljama u međunarodnom tržištu.

Stoga kineski proizvođači krvnih proizvoda moraju poboljšati proizvodni proces, ojačati inaktivaciju i uklanjanje virusa, kako bi u potpunosti osigurali kvalitetu i sigurnost proizvoda. Stoga će kineski proizvođači krvnih proizvoda biti u trendu da koriste hromatografiju za pročišćavanje krvnih proizvoda i uklanjanje virusa kako bi osigurali sigurnost krvnih proizvoda.

 

O Guidlingu

 

Guidling Technology je nacionalna kompanija visoke tehnologije koja se fokusira na biofarmaceutike, ćelijsku kulturu, prečišćavanje i koncentraciju biomedicine, dijagnostiku i industrijske tekućine. Uspješno smo razvili centrifugalne filter uređaje, ultrafiltracione i mikrofiltracione kasete, virusni filter, TFF sistem, dubinski filter, šuplja vlakna, itd. Koji u potpunosti zadovoljavaju scenarije primjene biofarmaceutika, ćelijske kulture itd. Naše membrane i membranski filteri se široko koriste u koncentraciji, ekstrakciji i odvajanju predfiltracije, mikrofiltracije, ultrafiltracije i nanofiltracije. Naše brojne linije proizvoda, od malih, za jednokratnu upotrebu laboratorijske filtracije do proizvodnih sistema filtracije, testiranja sterilnosti, fermentacije, ćelijske kulture i više, zadovoljavaju potrebe testiranja i proizvodnje. Guidling Technology se raduje saradnji sa vama!