Potpuna analiza procesa proizvodnje MRNA lijekova: kako TFF tehnologija rješava izazove pročišćavanja

Poslednjih godina, mRNA tehnologija je postigla revolucionarni napredak u biofarmaceutskom polju, pokazujući ogroman potencijal primene, posebno u vakcinama i genskoj terapiji. Uspješan razvoj mRNA vakcina ne samo da je pružio nova rješenja za prevenciju i kontrolu zaraznih bolesti, već je također pokrenuo napredak u imunoterapiji raka i personaliziranoj medicini. Kao nova klasa terapijskih proizvoda, proizvodnja mRNA velikih-razmjera predstavlja veliki izazov, uključujući kontrolu stabilnosti RNK, uklanjanje rezidualnih enzima i reakcijskih proizvoda-proizvoda, razmjenu pufera i postizanje visokih-stopa oporavka čistoće, a sve to zahtijeva proizvodne tehnologije sa regulatornim- rješenjima.

Proces proizvodnje mRNA vakcina ili terapeutika uglavnom je podeljen u tri faze: priprema plazmidne DNK rastvora, priprema rastvora mRNA u masi i priprema leka mRNA-LNP.

Dijagram toka procesa proizvodnje mRNA lijekova

 

Tangencijalna protočna filtracija (TFF), kao -uhodana tehnologija membranskog odvajanja, široko se primjenjuje u proizvodnji mRNA zbog svoje visoke-sposobnosti molekularnog prosijavanja, kontrolirane izmjene pufera i niskih karakteristika smičnog naprezanja. Zasnovano na dizajnu membranskog modula, uobičajene TFF konfiguracije uključuju ravne-kasete sa listovima i module sa šupljim-vlaknima. Osim toga, membransko odvajanje - pod pritiskom u TFF-u može se klasificirati na mikrofiltraciju (MF), ultrafiltraciju (UF), nanofiltraciju (NF) i reverznu osmozu (RO) prema veličini pora membrane, sa progresivno rastućom selektivnošću.

 

TFF igra kritičnu ulogu u više faza proizvodnje mRNA lijeka, uključujući pripremu plazmidne DNK, masovnu proizvodnju mRNA i konačnu formulaciju mRNA-LNP lijekova. Odgovarajućim odabirom tipa membrane, molekularne težine (MWCO) i materijala membrane, TFF omogućava efikasno uklanjanje nusproizvoda-proizvoda i nečistoća niske-molekularne-težine, dok također olakšava razmjenu pufera i koncentraciju prije i nakon LNP inkapsulacije. Ovo značajno poboljšava čistoću RNK, stabilnost i ukupnu skalabilnost procesa.

 

Pored toga, na performanse filtracije tangencijalnog protoka utiču faktori konfiguracije sistema kao što su tip pumpe i dizajn cevi, kao i ključni parametri procesa uključujući transmembranski pritisak (TMP), napon smicanja i fluks filtracije. Ovi faktori moraju biti pažljivo odabrani i optimizirani na osnovu karakteristika ciljnog proizvoda, posebno za proizvode osjetljive na stres-kao što je mRNA-LNP, koji su veoma osjetljivi na vanjske mehaničke sile tokom obrade.

 

Prečišćavanje plazmidne DNK

Priprema osnovnog rastvora plazmidne DNK je u osnovi zasnovana na dizajnu sekvence šablona za transkripciju. Metode pripreme obično uključuju amplifikaciju plazmidne DNK, iako se može koristiti i PCR amplifikacija. Uzimajući DNK amplifikaciju kao primjer, projektovanuE. colise obično koristi za fermentaciju{0}}baziranu amplifikacija. Nizvodni proces prečišćavanja uglavnom uključuje prikupljanje ćelija, lizu i bistrenje, koncentraciju i razmenu pufera, sterilnu filtraciju, linearizaciju i hromatografsko prečišćavanje. U industrijskim postavkama, centrifugiranje s kontinuiranim{3}}tokom se često koristi za sakupljanje ćelija, ali stvara relativno visoke sile smicanja. Sistemi šupljih vlakana, sa svojim otvorenim kanalima i niskim smicanjem, pogodniji su za rukovanje uzorcima s visokim sadržajem čvrste tvari, visokim viskozitetom ili osjetljivošću na smicanje, kao što je plazmidna DNK. Nakon sakupljanja, ćelije se podvrgavaju homogenizaciji visokog{6}}pritiska, ultrazvuku ili alkalnoj lizi, nakon čega slijedi preliminarno bistrenje kroz dubinsku filtraciju.

 

Da bi se olakšala naknadna hromatografija, često se prvo koristi filtracija tangencijalnog protoka (TFF) pomoću membranskih kaseta ili kolona sa šupljim vlaknima s molekulskom težinom-odreza od 30 kDa, 100 kDa ili 300 kDa za koncentraciju i razmjenu pufera. Ovo smanjuje zapreminu uzorka uz istovremeno uklanjanje nekih nečistoća kao što su RNK, proteini ćelije domaćina (HCP) i DNK fragmenti ćelije domaćina (HCD). Kromatografija služi kao osnovni korak prečišćavanja. Tipično, hromatografija anjonske izmene (AEX) se kombinuje sa hromatografijom hidrofobne interakcije (HIC) za efikasno uklanjanje nečistoća i obogaćivanje visoko bioaktivne supersmotane plazmidne DNK, čime se značajno poboljšava čistoća plazmida.

 

Nakon pročišćavanja, plazmid se ponovo podvrgava TFF-u da bi se otopina koncentrirala do ciljne koncentracije (obično 0,5-2 mg/mL) i da se izvrši dijaliza s konačnim puferom za skladištenje. Ovaj korak uklanja zaostale soli i organske rastvarače iz procesa, osiguravajući da puferski sistem ispunjava zahtjeve za nizvodne reakcije in vitro transkripcije (IVT).

 

Prečišćavanje in vitro transkribovane (IVT) mRNA

In vitro transkripcija (IVT) i modifikacija su ključni procesi za pripremu osnovnih rastvora mRNA. Tokom proizvodnje IVT mRNA, koristi se kombinacija filtracije tangencijalnog protoka (TFF1) – hromatografije – filtracije tangencijalnog protoka (TFF2). Ova strategija osigurava efikasno i{4}}kvalitetno pročišćavanje mRNA, pružajući kritičnu podršku za proizvodnju vakcine.

Nakon što se završe reakcije transkripcije i modifikacije, obično se prvo izvodi ultrafiltracija/dijafiltracija pomoću membranskih kaseta ili kolona sa šupljim vlaknima s molekulskom težinom od-odreza od 30 kDa, 100 kDa ili 300 kDa. Ovaj korak efikasno uklanja različite nečistoće povezane sa procesom-iz reakcionog sistema, kao što su RNA polimeraza, zaostali DNK fragmenti, neizreagovani NTP, enzimi za zatvaranje, dvolančana RNK (dsRNA) i inhibitori malih -molekula, dok se istovremeno postiže razmjena pufera. Nakon jednog koraka filtracije tangencijalnog protoka, većina nečistoća se efikasno uklanja, a jedina detektabilna zaostala proteinska nečistoća je RNA polimeraza.

Nakon toga se primjenjuju višestruke hromatografske tehnike za dalje prečišćavanje. Uobičajene metode uključuju afinitetnu hromatografiju, hromatografiju{1}}ekskluzivnu hromatografiju, hromatografiju sa jonskim-parom reverzne{3}}fazne hromatografije i hromatografiju sa jonskom izmenom. Kroz ovu kombinaciju ultrafiltracije i sekvencijalne hromatografije, mRNA postiže visok nivo čistoće.

 

Da bi se ispunili zahtjevi formulacije ili skladištenja, osnovni rastvor mRNA se ponovo koncentriše ili razrijedi pomoću 30 kDa, 100 kDa ili 300 kDa membranskih kaseta ili kolona sa šupljim vlaknima kako bi se precizno podesila ciljna koncentracija i razmjenjivala u puferu za konačnu formulaciju. Konačno, sterilna filtracija -primijenjena je za kontrolu mikrobnog opterećenja, čime se završava privremeno skladištenje i punjenje materijala.

Exploration of TFF-related process parameters: Relevant studies have shown that a membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kDa provides the optimal purification efficiency; the transmembrane pressure (TMP) should not exceed 5 psi; and an mRNA concentration of 1 mg/mL ensures a relatively high permeate flux (>25 LMH).

 

Prečišćavanje mRNA-LNP formulacija

Lipidne nanočestice (LNP) su trenutno najopsežnije proučavani sistem za isporuku mRNA terapeutika. Trenutno su različite formulacije mRNA-LNP u različitim fazama pretkliničkog i kliničkog razvoja. LNP-ovi su vrlo osjetljivi na proizvodne procese. Među operacijama jedinica koje su potrebne za proizvodnju mRNA-LNP, koncentracija i izmjena pufera putem filtracije tangencijalnog protoka (TFF) kao i sterilna filtracija predstavljaju značajne izazove. Ovi koraci moraju biti pažljivo optimizirani kako bi se osigurala skalabilnost procesa i kvalitet proizvoda, uz izbjegavanje problema kao što su onečišćenje membrane i neispravno punjenje filtera.

 

Nakon inkapsulacije mRNA, za pročišćavanje se koristi filtracija tangencijalnog protoka (TFF). Svrha ovog koraka je uklanjanje nekapsulirane mRNA, slobodnih polimera ili lipidnih materijala, kao i zaostalih rastvarača iz mRNA i lipida. Budući da mRNA-LNP pokazuju ograničenu stabilnost na sobnoj temperaturi, optimizacija nizvodnih procesa, uključujući TFF, je kritična za održavanje kvaliteta proizvoda.

Ključni pravci optimizacije uključuju: odgovarajuće postavljanje transmembranskog pritiska (TMP) i tangencijalne brzine protoka na osnovu veličine čestica i stabilnosti mRNA-LNP-a kako bi se uravnotežila efikasnost filtracije i stres čestica; odabir membrana ili kolona šupljih vlakana sa odgovarajućim graničnim vrijednostima molekulske težine (MWCO, npr. 100 kDa ili 300 kDa) za efikasno uklanjanje slobodne mRNA, nečistoća i pufera za razmjenu uz minimiziranje adsorpcije ili oštećenja čestica; i optimiziranje koncentracije i volumena dijafiltracije kako bi se osigurala efikasna izmjena pufera u ciljnu formulaciju i kontrola konačne koncentracije i disperzije čestica.

 

Osim toga, kritični atributi kvaliteta (kao što su veličina čestica, indeks polidisperznosti [PDI] i efikasnost inkapsulacije mRNA) moraju se pažljivo pratiti tokom procesa, a parametri se dinamički prilagođavati na osnovu podataka u stvarnom-vremenskom vremenu kako bi se postiglo stabilno, skalabilno i efikasno pročišćavanje i formulacija mRNA-LNP-a.

 

Osim toga, zbog nestabilnosti mRNA-LNP-ova i njihovih komponenti pod terminalnim metodama sterilizacije, 0,2 µm sterilni-filter se obično koristi za uklanjanje bakterija i drugih mikrobnih kontaminanata.