Studija o procesu bistrenja fermentacionog lizata visoke gustine rekombinantne Escherichia Coli

 

Kako bi se smanjila interferencija materijalne tekućine na hromatografiju i poboljšao oporavak ciljnog proteina, proučavan je proces bistrenja fermentacionog lizata visoke gustine dva soja rekombinantne Escherichia coli. Odabrani su sojevi BL21-HP1036 i BL21-palA koji eksprimiraju ključne gene Streptococcus suis i Haemophilus parasuis. Proces tangencijalnog toka, proces centrifugiranja velike brzine i proces bistrenja membranske kasete korišteni su za procjenu prinosa proteina detekcijom zamućenosti i elektroforezom.

 

Rezultati su pokazali da su BL21-HP1036, BL21-palA fermentacijski lizat visoke gustine koji eksprimiraju ključne gene Streptococcus suis i Haemophilus parasuis bistreni filtracijom i centrifugiranjem membranske kasete, a prinos proteina je bio preko 80%. što bi moglo efikasno smanjiti hromatografske smetnje i poboljšati stopu oporavka.

 

Uvod

Trenutno su Streptococcus suis (SS) i Haemophilus parasuis (HPS) najčešći uzročnici bakterijskih bolesti na farmama svinja, koji donose velike gubitke industriji svinja. SS se može podijeliti na ukupno 35 serotipova 1-34 i 1/2, a HPS se može podijeliti na 1-15 serotipove, a ova dva se često miješaju, uglavnom uzrokujući poliserozitis svinja, artritis, meningitis, endokarditis , bakterijska septikemija i bronhitis.

 

Zbog velikog broja serotipova Streptococcus suis i Haemophilus parasuis, unakrsna zaštita između različitih serotipova je slaba, a rezistencija na antibiotike će se značajno povećati kada se liječi antibioticima, što će uticati na terapijski učinak.

 

Vakcine su postale jedno od efikasnih sredstava za prevenciju SS i HPS. Postoje inaktivirane vakcine, atenuirane vakcine, žive vakcine, podjedinične vakcine i genetski modifikovane vakcine, ali inaktivirane vakcine i atenuirane vakcine su uglavnom na tržištu, i njihova imunološka zaštita je dobra, ali unakrsna zaštita nije očigledna. Subjedinična vakcina je nova vrsta vakcine protiv streptococcus suis, koja je nova vrsta vakcine sa jakom unakrsnom zaštitom i niskom cijenom. Istraživanje i razvoj podjediničnih vakcina protiv Streptococcus suis i Haemophilus parasuis pruža savršeno rješenje za prevenciju i kontrolu problema Streptococcus suis i Haemophilus parasuis koji muče industriju svinja u Kini.

 

Streptococcus suis i Haemophilus parasuis podjedinične vakcine su podvrgnute fermentaciji visoke gustine pomoću rekombinantne Escherichia coli. Bistrenje lizata ima veliki uticaj na prinos ciljnih proteina, ali postoji nekoliko relevantnih izveštaja. Kako realizirati korak bistrenja procesa fermentacije i prečišćavanja je važan posao. U ovom radu, rekombinantna E. coli BL21-HP1036, BL21-palA fermentacija visoke gustine kao predmet, radi proučavanja kako efikasno smanjiti zamućenost rastvora za bistrenje, poboljšati prinos proteina, za Proces fermentacije podjedinične vakcine Streptococcus suis kako bi se postigla tehnologija industrijskog drobljenja i bistrenja za pružanje teorijske osnove i tehničke podrške.

 

1. Materijali i metode

1.1 Materijali

 

1.1.1 Sojevi

Streptococcus suis i Haemophilus parasuis sojevi BL21-HP1036, BL21-pa-lA

 

1.1.2 Glavni mediji i reagensi

Ekstrakt kvasca i pliskavice; Natrijum hlorid; Kanamicin, IPTG; Formaldehid iz; SDS-PAGE gel komplet.

 

1.1.3 Glavna oprema za ispitivanje

Fermentator visoke gustine; Centrifuga velike brzine; Aparati za elektroforezu; Ultraljubičasti gel sistem za snimanje; Ultrasonic crusher; Mala centrifuga velike brzine; Ultraljubičasti spektrofotometar; Sto za protresanje konstantne temperature; Oprema za afinitetnu hromatografiju.

 

1.2 Metode

 

1.2.1 Kultura fermentacije visoke gustine

Kvalificirani rekombinantni sojevi koliforma BL21-HP1036 i BL21-pa-lA inokulirani su na sintetičkom mediju pri 2% (V/V) i kultivirani na 37 stepeni 35-40 h.

 

1.2.2 Ekspresija izazvana rekombinantnim proteinom

Kada je rastvor za fermentaciju OD{{0}}±0.1, indukcija je započela, temperatura indukcije je bila 35 stepeni ±0,5 stepeni, a kultura je završena nakon 10 sati indukcije.

 

1.2.3 Homogeno drobljenje i centrifugiranje pod visokim pritiskom

Bakterijska tečnost koja je prošla test inaktivacije usitnjena je homogenizatorom visokog pritiska za pucanje ćelija, respektivno, sa pritiskom od 100~150 MPa. Nakon drobljenja, zgnječena tečnost je držana na niskoj temperaturi.

Supernatant je dobijen centrifugiranjem velikom brzinom, centrifugalna brzina: 15000 rpm, kontrola temperature: 10 stepeni ~15 stepeni, brzina ubrizgavanja: 0,5~1 L/min, respektivno, supernatant je sakupljen, i supernatant je napunjen kontejnerima koji su uklonili endotoksin.

 

1.2.4 Pročišćavanje kasete sa mikrofiltracionom membranom

Membrana je isprana sa 10L prečišćene vode u jednom smjeru i izvršena je tangencijalna protočna filtracija. 300 mL razbijene bakterijske suspenzije nakon centrifugiranja uzeto je iz cjevovodne centrifuge i bistreno sa 0,45 um mikrofiltracionom membranskom kasetom. Zamućenost je mjerena uzorkovanjem respektivno, a upoređivana je zamućenost nakon centrifugiranja, zamućenost pročišćene tekućine u kaseti s membranom za mikrofiltraciju i zamućenost koncentrirane tekućine u kaseti za mikrofiltracijsku membranu. Sadržaj proteina u uzorku je detektovan hromatografijom i elektroforezom da bi se procenio prinos proteina.

 

Korak 2: Rezultati

2.1 Podaci pojašnjenja i rezultati testa BL21-HP1036 i BL21-palA proteina

Rezultati na Sl. 1 pokazuju da je zamućenost BL21-HP1036 i BL21-palA rekombinantne Escherichia coli tekućine za drobljenje smanjena sa 4 500 NTU i 4 000 NTU na 1970 NTU i 520 NTU, respektivno, nakon centrifugiranja epruvete. Zamućenost BL21-HP1036 i BL21-palA rekombinantne Escherichia coli smanjena je na 25 NTU i 1,28 NTU metodom mikrofiltracione membranske kasete. Može se vidjeti da upotreba tangencijalne filtracije toka kasete s membranom za mikrofiltraciju i optimiziranog otvorenog kanala protoka ima dobar učinak na smanjenje endotoksina, viskoziteta i zamućenosti kromatografske tekućine od tradicionalne filtracije centrifugom, te može značajno smanjiti slomljeni rekombinantni heteroprotein E. coli i nukleinske kiseline.

 

2.2 Obnavljanje proteina BL21-HP1036 i BL21-palA uzoraka

Tabela 1 pokazuje da rekombinantni protein Escherichia coli BL21-HP1036 postoji i u mikrofiltracijskom bistrenom rastvoru iu koncentrovanom supernatantu prekrivenom mikrofiltracionom membranom, i ukupan prinos proteina nakon oporavka proteina iz bistrenog rastvora mikrofiltracijom i koncentrovanog supernatanta iznosi oko 88,5%. BL21-palA protein je takođe postojao u bistrenom rastvoru eksudata mikrofiltracije i supernatantu koncentrovanog rastvora prekrivenom kasetom za mikrofiltracionu membranu. Ukupan prinos BL21-PALa proteina bio je 81,5%.

 

3. Zaključak

U ovom radu, sojevi koji eksprimiraju ključne gene BL{{0}}HP1036 i BL21-palA Streptococcus suis i Haemophilus parasuis su podvrgnuti fermentaciji visoke gustine i prošli su 0,45 Zamućenost tečnosti materijala je bila značajno smanjen postupkom kasete s mikrofiltracionom membranom, što ukazuje da je tehnologija filtracije tangencijalnog protoka s mikrofiltracijskom membranskom kasetom bila bolja od one sa centrifugom velike brzine i mogla bi značajno smanjiti nečistoću proteina i nukleinske kiseline slomljene rekombinantne Escherichia coli.

 

Nakon sakupljanja bistre tečnosti u jednoj kaseti za mikrofiltracionu membranu, bilo je 62,9% jer je 37,1% ciljnog proteina BL21-HP1036 bio koncentrat mikrofiltracije ili je postojao u kaseti za mikrofiltracionu membranu i drugi gubici , za pojašnjenje je usvojena metoda u dva koraka. U prvom koraku, 0,45um mikrofiltraciona membranska kaseta je korištena za pročišćavanje i sakupljanje eksudata; u drugom koraku, preostala koncentrisana tečnost je sakupljena nakon centrifugiranja u epruveti, a dvostepena bistrena tečnost je kombinovana kao hromatografski uzorak. Vrijednost zamućenja BL21-palA fermentacijske tekućine nije se značajno povećala, prinos proteina je mogao dostići više od 85,5%, a prinos proteina BL21-Pala fermentacijske tekućine mogao bi dostići 81,5% nakon tretmana u dva koraka.

 

Što se tiče odabira kasete s membranom za mikrofiltraciju, Guidling Technology vam može pružiti visokokvalitetna rješenja. Naši proizvodi serije kaseta za mikrofiltracionu membranu i ultrafiltracionih membranskih kaseta koriste polieter sulfon kao nosač, posebno dizajniran za biotehnologiju. Naša polieter sulfonska membrana ima prednosti visoke propusnosti, niske adsorpcije proteina, visoke mehaničke čvrstoće, otpornosti na udar i tako dalje. Pružamo vam specijalne membranske stezaljke za mjerenje tlaka na ulazu i izlazu u realnom vremenu i možemo vam pružiti tehničke posjete prema vašim potrebama kako biste prilagodili vaš specijalni ultrafiltracijski/mikrofiltracijski sistem. Takav sistem malog tangencijalnog protoka može se koristiti za malu, pilotsku i malu proizvodnju, i može biti potpuno linearno pojačanje kako bi u potpunosti zadovoljio vaše zahtjeve za ispitivanje i zahtjeve proizvodnje.

O Guidlingu

Guidling Technology je nacionalna kompanija visoke tehnologije koja se fokusira na biofarmaceutike, ćelijsku kulturu, prečišćavanje i koncentraciju biomedicine, dijagnostiku i industrijske tekućine. Uspješno smo razvili centrifugalne filter uređaje, ultrafiltracione i mikrofiltracione kasete, virusni filter, TFF sistem, dubinski filter, šuplja vlakna, itd. Koji u potpunosti zadovoljavaju scenarije primjene biofarmaceutika, ćelijske kulture itd. Naše membrane i membranski filteri se široko koriste u koncentraciji, ekstrakciji i odvajanju predfiltracije, mikrofiltracije, ultrafiltracije i nanofiltracije. Naše brojne linije proizvoda, od malih, za jednokratnu upotrebu laboratorijske filtracije do proizvodnih sistema filtracije, testiranja sterilnosti, fermentacije, ćelijske kulture i više, zadovoljavaju potrebe testiranja i proizvodnje. Guidling Technology se raduje saradnji sa vama!