Membranska tehnologija i pojašnjenje vakcine (Ⅰ)
Vakcine dolaze iz različitih izvora, uključujući ekstrakte tkiva, bakterijske ćelije, virusne čestice, proteine i nukleinske kiseline koje proizvode rekombinantne ćelije sisara, ćelije kvasca i insekata.
Najčešći način proizvodnje vakcine zasniva se na početnom procesu fermentacije nakon čega slijedi prečišćavanje. Proizvodnja vakcine je složen proces koji uključuje mnogo različitih koraka i procesa. Odabir odgovarajuće metode prečišćavanja je ključan za postizanje željene čistoće finalnog proizvoda. Pojašnjenje vakcina je važan korak koji ima značajan uticaj na oporavak proizvoda i naknadno prečišćavanje. Za razjašnjavanje vakcina može se koristiti nekoliko tehnika. Izbor metode prikupljanja i opreme ovisi o vrsti baterije, prirodi proizvoda koji se sakuplja i procesnoj tekućini. Ove tehnike uključuju membransku filtraciju (mikrofiltraciju, filtraciju tangencijalnog protoka), centrifugiranje i dubinsku filtraciju (normalna filtracija protoka). Iz dugogodišnjeg iskustva, bistrenje vakcine obično se postiže centrifugiranjem nakon čega slijedi duboka filtracija.
Posljednjih godina, tehnike zasnovane na membrani dobile su na značaju u razjašnjavanju vakcina. Upstream procesi sve više koriste tehnologije za jednokratnu upotrebu, tako da se strategije žetve moraju promijeniti. Ovaj članak pruža sveobuhvatan pregled različitih tehnologija zasnovanih na membrani i njihove primjene u razjašnjavanju vakcina.
01 Uvod
Vakcine su kritična komponenta naše prevencije zaraznih bolesti, koje ostaju šokantni uzrok smrti. Između 2 i 3 miliona ljudi se svake godine spasi od difterije, tetanusa, velikog kašlja i malih boginja zahvaljujući imunizaciji. Vakcine pokrivaju širok raspon, od malih rekombinantnih proteina do cijelih virusnih čestica i cijelih bakterija. Mogu ih proizvoditi različiti sistemi: jaja, ćelije sisara, bakterije itd. Zbog složenosti i raznolikosti vakcina, trenutno ne postoji glavni protokol za pročišćavanje ili šablon, uprkos rastućem interesovanju za platforme vakcina.
Obično se proces vakcine može podijeliti na tri dijela: uzvodno (proizvodnja i bistrenje), nizvodno liječenje (prečišćavanje uključujući ultrafiltraciju, hromatografiju i kemijski tretman) i formulaciju (operacije konačnog punjenja). Nezavisno od proizvodnog sistema, bistrenje (početno uklanjanje neželjenih supstanci) igra ključnu ulogu u određivanju snažnog procesa prečišćavanja. Odgovarajući korak bistrenja uglavnom uklanja cijele ćelije, ćelijske ostatke, koloide i velike agregate kako bi se smanjio teret daljnje obrade. U nekim slučajevima, bistrenje takođe može smanjiti netopive nečistoće, proteine ćelije domaćina (HCP) i nukleinske kiseline ćelije domaćina. Kao i svaki drugi korak pročišćavanja, korak bistrenja mora biti optimiziran kako bi se postigao maksimalni prinos i čistoća proizvoda uz prilagođavanje specifičnosti i proizvodnim ograničenjima vakcine.
Zbog heterogenosti tipova vakcina, za bistrenje se koriste različite tehnike, uključujući centrifugiranje ili filtraciju (Tabela 1).
Obično je potrebno nekoliko serija operacija da bi se postiglo željeno pojašnjenje. Prva operacija je dizajnirana za uklanjanje većih čestica (primarno bistrenje), a druga operacija je dizajnirana za uklanjanje koloida i drugih submikronskih čestica (sekundarno bistrenje). Centrifugiranje pri maloj brzini služi kao jednokratna opcija za pročišćavanje, omogućavajući ćelijama i ćelijskim ostacima da se uklone precipitacijom. Centrifugiranje može podnijeti velika čvrsta opterećenja i široko se koristi u šaržnom ili kontinuiranom načinu rada i centrifugama s diskovima. Zahtijeva velike kapitalne investicije i troškove održavanja i suočava se s izazovima u povećanju zbog nedostatka pouzdanog modela smanjenja. Međutim, neki komercijalni proizvođači vakcina koriste centrifuge u velikoj proizvodnji koja uključuje velike količine obrade i više proizvodnih aktivnosti.
Filtracija za bistrenje može se izvesti pomoću normalne protočne filtracije (NFF, također poznata kao filtracija u slijepoj ulici) ili filtracije tangencijalnog protoka (TFF, također poznata kao filtracija u poprečnom toku). Postoje i specifični načini filtera (duboki filteri) koji sadrže pozitivno nabijene materijale i filter AIDS koji poboljšavaju zadržavanje staničnih ostataka, koloida i negativno nabijenih neželjenih komponenti.
Membranski filteri zadržavaju čestice isključenjem veličine i nemaju visok kapacitet zadržavanja prljavštine, pa su pogodni za sekundarne korake bistrenja. I dubinski i membranski filteri se lako skaliraju i implementiraju (jednostavan dizajn sistema). Za razliku od NFF, TFF se uglavnom koristi za primarno bistrenje (mikrofiltracija). Membrane sa graničnim opsegom od 0.1-0.65 μm (po mogućnosti sa otvorenim kanalom) uspješno su korištene za zadržavanje ćelija, ćelijskih ostataka i drugih velikih kontaminanata. Većina TFF opreme je linearno skalabilna i ponovno upotrebljiva nakon čišćenja, što značajno smanjuje troškove potrošnog materijala za korak.
Korak razjašnjavanja leži između procesa uzvodno i nizvodno i ponekad se zanemaruje tokom razvoja procesa vakcine jer su vrijeme i resursi prioritet za druge korake prečišćavanja, kao što su hromatografija ili centrifugiranje u gradijentu gustine.
Čak i patenti za procese proizvodnje vakcina često izostavljaju korak pojašnjenja. Efikasnost bistrenja direktno utiče na performanse procesa koji se nastavlja. Loše optimiziran korak bistrenja može negativno utjecati na kapacitet steriliziranog filtera ili može skratiti vijek trajanja kromatografske smole. Danas, stroža regulatorna očekivanja imaju tendenciju da proizvođači vakcina proizvode čistije, dobro okarakterisane, ali pristupačne vakcine. U tom slučaju svakom koraku treba posvetiti pažnju koju zaslužuje. Trenutni trendovi sugeriraju da se uzvodni proces kreće prema "čišćem" sistemu ekspresije (tj. ćelije kultivirane u podlozi bez seruma zamjenjuju jaja) sa povećanom produktivnošću i većom gustinom ćelija.
Daljnji procesi prečišćavanja se pojednostavljuju i pojednostavljuju kako bi se povećala čistoća konačnog proizvoda. Za rješavanje ovih promjena, korak pojašnjenja ne može postati usko grlo. U ovom slučaju, tehnologija filtracije susreće se s novim izazovom razjašnjavanja, rješavajući pitanja povećane fleksibilnosti procesa, mogućnosti jednokratne upotrebe i smanjenih troškova ulaganja.
02 Pojašnjenje virusnih vakcina
Nekoliko vrsta metoda bistrenja, bilo samostalno ili u kombinaciji, uspješno je korišteno za razjašnjavanje žetve na kraju cjepiva.
Pilot skala :1-20L, proizvodna skala: više od 20L
2.1 Mjere opreza za pojašnjenje virusne vakcine
Mnoga cjepiva sadrže sve ili dio virusnih čestica za stvaranje imuniteta protiv virusne infekcije. Oni generalno spadaju u četiri široke kategorije:
Živa atenuirana vakcina (LAV), koja se zasniva na oslabljenom soju virusa kako bi se smanjila njegova virulencija. Oslabljeni virusi se mogu razmnožavati u tijelu, ali nisu patogeni.
- Vakcine sa inaktiviranim virusom (IV), koje sadrže hemijski ili ultraljubičastim inaktiviranim virusima za uklanjanje infektivnosti. Virusne čestice mogu biti kompletne, podijeljene ili pročišćene (samo antigeni proteini).
- Vakcina virusnog vektora (VV) je aktivan, nepatogen virus koji predstavlja antigen patogenog virusa. Ove nedavno razvijene strukture se također koriste za primjenu genske terapije.
Vakcine nalik virusima (VLPs), specifična klasa virusnih podjedinica vakcina koje oponašaju ukupnu strukturu virusnih čestica, ali ne sadrže infektivni genetski materijal.
U većini slučajeva, virusne čestice su potpuno netaknute tokom koraka bistrenja, čak i tokom lize virusne vakcine (cijepanje se obično vrši nizvodno, u pročišćenijem okruženju).
Glavni izazov bistrenja virusa je oporavak virusnih čestica visokog prinosa uz efikasno uklanjanje ćelijskih ostataka, velikih agregata i netopivih kontaminanata. Kao što je opisano u sljedećim odjeljcima, postoji nekoliko faktora koji mogu uzrokovati degradaciju ili gubitak virusa. Osim toga, može biti teško osloniti se na prinos virusa zbog velike varijabilnosti virusnih kvantitativnih metoda analize u ovoj fazi procesa, posebno za vakcine protiv LAV i VV. Za ove vakcine, prinos virusa se često procenjuje pomoću testova infektivnosti kao što je test plaka ili TCID 50 test. Činjenica da neki od prikupljenih spojeva mogu ometati sposobnost virusa da inficira indicirajuće stanice povećava varijabilnost ovog kvantitativnog pristupa.
2.2 Strategija razjašnjenja vakcine protiv virusa
Virusne vakcine se veoma razlikuju po veličini, strukturi, obliku i ekspresijskim sistemima (tabela 3).
Kao rezultat toga, generalno ne postoji obrazac za nizvodne procese, posebno korake pojašnjenja. U teoriji, sve dostupne tehnike (centrifugiranje pri malim brzinama, mikrofiltracija TFF, NFF) mogu se odabrati i potencijalno kombinirati kako bi se razjasnio virus. U stvari, na uspeh metoda bistrenja utiču sistem ekspresije i fizičko-hemijska svojstva uključenih virusa.
Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>{{0}} ćelija /ml) metoda bistrenja, korištenjem kationskih polimera, smanjila je područje duboke filtracije za 4 puta u poređenju sa tradicionalnim metodama. Ova tehnika omogućava berbu fermentora velikog kapaciteta bez upotrebe centrifuga. Slično, Riske et al. pokazalo je da je tretman hitozanom 40 L ćelijskih kultura (0,02%) koje sadrže 1.4-2.6% čvrste tvari doveo do 7-puta povećanja apsolutnog kapaciteta filtera nakon dubinske filtracije.
Oni također spominju da se čini da hitozan poboljšava efikasnost bistrenja flokulirajućim submikronskim česticama, koje se obično talože u centrifugama. Metode prethodnog tretmana i flokulacije će vjerovatno i dalje biti dio budućih pojašnjenja filtracije vakcine. Penetanti, uključujući šećere, glikole i aminokiseline, prvenstveno flokuliraju viruse. Virusna flokulacija osmotskom otopinom praćena mikrofiltracijom 0.2µ može se koristiti kao sveobuhvatan proces za pročišćavanje virusa. Penetanti mogu stimulirati agregaciju virusa tako što smanjuju hidratacijski sloj oko čestica kako bi flokulirali hidrofobne nekapsulirane virusne čestice i inkapsulirane virusne čestice. Iako se pokazalo da penetranti flokuliraju viruse, metoda ima potencijal da bude platforma za buduće pročišćavanje vakcine, a nije dokazana njena izvodljivost u pilot ili masovnom pročišćavanju vakcine. Metoda predtretmana flokulacijom, koja će vjerovatno i dalje biti dio budućeg bistrenja filtera za vakcinu, izvodi se u fermentoru od 2L. Da bi se potencijalno koristile u velikim proizvodnim operacijama, ove metode moraju biti validirane na pilot i proizvodnim skalama.
2.2.1 Izražavanje uticaja sistema
Metoda bistrenja uglavnom zavisi od vrste prethodnog procesa i ekspresionog sistema, koji određuje vrstu i nivo zagađivača koji se uklanjaju. Virusne vakcine se obično proizvode u pilećim embrionima putem kontinuiranih ćelijskih linija sisara ili ptica ili ćelija bakulovirusa/insekata, koje su složeniji sistem ekspresije. Neke vrste VLP-a mogu takođe biti proizvedene drugim heterolognim ekspresionim sistemima (bakterije, kvasac, biljne ćelije).
2.2.1.1 Virus proizveden u pilećem embrionu
Vakcine se proizvode u jajima decenijama. Ovaj rad datira iz 1931. godine, kada su Woodruff i Good Pasture uspješno koristili korio-alantoičnu membranu plodnih jaja kao supstrat za rast virusa. Danas se mnoga ljudska i veterinarska cjepiva još uvijek proizvode korištenjem ovog drevnog procesa. Najpoznatija je vjerovatno vakcina protiv sezonskog gripa. Princip je da se kokošja jaja inokuliraju virusima od interesa, a zatim se repliciraju u korio-alantoičnoj membrani. Nakon razmnožavanja sakuplja se i pročišćava alantoična tečnost bogata virusnim česticama.
Alantoična tečnost je izazovna hrana za bistrenje. Visok sadržaj minerala i proteina (uključujući ovalbumin) daje mu visok viskozitet. Alantoična tečnost takođe sadrži esencijalna jedinjenja tkiva iz pilećih embriona, kao što su perje, kljunovi, krvni sudovi ili krvna zrnca. Zbog visokog sadržaja čvrstih materija, centrifugiranje pri maloj brzini je poželjna opcija za primarno bistrenje, što obično rezultira stopom oporavka od oko 70%. Međutim, moguće je i primarno bistrenje pomoću tehnika filtracije. Za NFF, dubinski filteri na bazi polipropilena i celuloze imaju dobre sposobnosti sakupljanja alantoične tekućine. Površinski filteri napravljeni od polipropilena ili dubinskih filtera na bazi celuloze mogu imati kapacitet od 150-210 L/m² i smanjiti zamućenost protoka hrane do 3 puta. Otvoreni dovodni kanal TFF uređaj je također pogodan za prečišćavanje alantoične tekućine, jer je uređaj pogodniji za minimalni gubitak tlaka kroz dovodni kanal, čime se smanjuje blokada kanala.
Korak sekundarnog pojašnjenja može se lako obaviti pomoću NFF-a. Kombinacija materijala od polipropilena, celuloze i staklenih vlakana općenito pokazuje dobru efikasnost, a alternativa sekundarnom koraku bistrenja je korištenje TFF-a i {{0}}.65μm ili 0.45μm mikrofiltracionog membranskog uređaja i upravljanje osmotskim fluksom kontrolu. U ovom koraku može se koristiti TFF uređaj otvorenog kanala s hidrofilnom PVDF ili hidrofilnom PES membranom.
Važno je napomenuti da virusne čestice mogu biti povezane s nerastvorljivim ostacima materijala, što može značajno smanjiti proizvodnju virusa tokom bistrenja. Korištenje otopine soli može smanjiti ovu povezanost između virusa gripe i čvrstih fragmenata, što rezultira otprilike dvostrukim povećanjem proizvodnje bez utjecaja na integritet virusnih čestica.
2.2.1.2 Virusi proizvedeni u uzastopnim ćelijskim linijama sisara i ptica
Nedavno su se neke virusne vakcine udaljile od procesa baziranih na jajima u korist procesa zasnovanih na kulturi ćelija (posebno za vakcine protiv gripa). Glavni razlog za ovu promjenu je sprječavanje problema s proizvodnjom cjepiva povezanih s embrionalnim jajima (tj. nedostatak opskrbe jajima koji se može pojaviti u slučaju bilo kakve epidemije bolesti peradi). Kao rezultat toga, mnoge vrste vakcina i virusnih vektora se trenutno razvijaju korištenjem kontinuiranih ćelijskih linija od sisara ili ptica, konvencionalnih ćelijskih linija (kao što su Vero, MDCK ili HEK293 ćelijske linije) ili vlasničkih ćelijskih linija.
Ovisno o sistemu ekspresije, virus može ostati unutar ćelije, što zahtijeva korak lize ćelije, ili može ostati izvan ćelije (liza ili pupanje). Čvrsto opterećenje i rastvorljivi sadržaj dobijen iz ćelijske kulture su mnogo čišći od alantoične tečne faze. Kao rezultat toga, NFF tehnologija je lakša za implementaciju, a kapacitet je znatno veći. Međutim, kapacitet filtracije je u velikoj mjeri ovisan o uvjetima kulture stanica, kao što su gustina ćelija ili vitalnost ćelija pri berbi. Ovi parametri utječu na količinu staničnih ostataka i makroagregata koji mogu začepiti duboke filtere i membrane, što rezultira smanjenim kapacitetom.
Thomassen i ostali pružaju dobar primjer pojašnjenja NFF-a. Koristi se u procesu proizvodnje inaktiviranog poliovirusa (IPV). Vero ćelije kultivisane na mikronosačima korišćene su za proliferaciju virusa sa gustinom ćelija od {{0}}.78 x 106 ćelija/ml TOI. Sito od nerđajućeg čelika od 75 μm koristi se za prethodno bistrenje kako bi se uklonili mikronosači iz žetve. Dvoslojno ocjenjivanje je razjašnjeno korištenjem dubinskog filtera gustine (0.2-2.0μm), nakon čega slijedi sterilizirani filter.
Odabrana skalabilna jedinica za jednokratnu upotrebu uspješno je korištena za pripremu Sabin IPV materijala za kliničko ispitivanje na skali od 350 L. U zavisnosti od serotipa virusa, postiže se stopa oporavka virusa od 86 do 96 posto.
2.2.1.3 Bakulovirus/čestice slične virusu proizvedene u sistemu ćelija insekata
Razmatranje sistema bakulovirusa/ćelija insekata za proizvodnju vakcina velikih razmera relativno je novo, ali privlači sve veći interes u oblasti virusnih vektora i VLP-ova. Glavna prednost ovog sistema je da uključuje kratkotrajnu (nema potrebe za uspostavljanjem ćelijskih linija) i sigurnu (bez kompletne virusne DNK) proizvodnju. Postoje i neki nedostaci, kao što je potreba za uklanjanjem bakulovirusa i stabilnost proizvoda.
Cervarix, VLP vakcina protiv infekcije humanim papiloma virusom koju proizvodi GlaxoSmithKline, prva je ljudska vakcina koja se komercijalno proizvodi u ćelijama insekata. Brojne vakcine zasnovane na VLP-ovima i rAAV vektorima proizvedenim u ćelijama insekata zaraženih bakulovirusom su trenutno u razvoju. Ćelijske linije insekata izvedene iz jesenjeg crva Spodoptera frugiperda (Sf9 i Sf21) i kupusnog crva Trichoplusia ni (BTI-TN5B1-4 ćelije) najčešće se koriste zbog njihove sposobnosti rasta u suspenziji, što pojednostavljuje uzvodno pojačanje proces. Nakon rasta do željene gustine živih ćelija, ove ćelije se inficiraju rekombinantnim bakulovirusom u fazi eksponencijalnog rasta ćelija radi ekspresije proteina. Veliki genom bakulovirusa omogućava ekspresiju pet ili više različitih proteina, što odgovara složenosti VLP i virusnih vektora.
Bernard et al. opisao nizvodni proces kulture ćelija insekata. Proces je vrlo varijabilan, što odražava raznolikost proteina proizvedenih ovom tehnikom. Na prvi korak sekvence prečišćavanja u velikoj meri utiču karakteristike zapremine bioreaktora (tj. gustina ćelija i vitalnost), ili priroda oslobađanja proizvoda (luči se pupanjem ili lizom ćelija). Bakulovirusna infekcija ćelija insekata može uzrokovati lizu ćelija u roku od 3-5 dana. Uništavanje ćelija može dovesti do povećanja proteolitičke aktivnosti i drugih faktora okoline koji mogu dovesti do razgradnje rekombinantnih proteina.
Bilo je pokušaja da se razviju bakulovirusi sa manjom sposobnošću iniciranja stanične lize. Bakulovirus lizira manje od 10 posto zaraženih insekata.
Liza ćelija se može izvesti različitim metodama, kao što su zamrzavanje-odmrzavanje, deterdženti, homogenizatori ili ultrazvučni tretman. Ćelije insekata nemaju ćelijski zid i stoga se brzo rastvaraju. Iako je ultrazvučni tretman zabilježen u mnogim procesima na klupi, rijetko se koristi u eksperimentalnoj ili komercijalnoj skali. Najčešća metoda je korištenje homogenizatora za uništavanje ćelija u prisustvu deterdženta niske koncentracije (0.1% Triton X-100 ili NP-40). Upotreba deterdženata i mikrofluidizacija ili homogenizacija osmotskim udarom uspješno se koriste u mnogim velikim proizvodnim procesima. Obično se ćelije insekata suspenduju u puferima za lizu (50 mM TRIS pH7.7, 300 mM NaCl, 5% glicerol, 0,2 mM PMSF i inhibitori proteaze), tokom čega Triton-X100 se dodaje do konačne koncentracije od 0,1%, nakon čega slijedi blagi ultrazvuk ili mikrofluidizacija. Smjesa se zatim centrifugira kako bi se uklonile nerastvorljive čestice.
U ovoj fazi, lizat može izgledati veoma zamućen i teško ga je filtrirati korištenjem filtera 0.45 μm. Ponekad se mogu uočiti gubici do 30% tokom koraka bistrenja pirolize. Dodavanje benzoenzima u fazi cijepanja pomaže u rješavanju problema filtracije. Čišćenje ćelija slanom otopinom fosfatnog pufera nakon žetve i brzo "zamrzavanje-odmrzavanje" u visokoj soli (500 mM NaCl) koja sadrži pufer za pucanje pomaže u uklanjanju agregata.
Čišćenje VLP-ova i virusnih vektora koje proizvode ćelije insekata događa se nakon ćelijske lize (hemijskom ili mehaničkom obradom), koja oslobađa ne samo virusne čestice već i velike količine ćelijske nukleinske kiseline. Ćelije insekata mogu rasti pri velikoj gustini ćelija, od 1-9.10 6 ćelija/ml. Stoga bi se korak bistrenja trebao baviti velikom gustinom stanica, visokim sadržajem nukleinske kiseline i, ako je moguće, uklanjanjem čestica bakulovirusa. Da stvar bude komplikovanija, VLP-ovi ili virusni vektori i bakulovirusi mogu imati slične veličine (bakulovirusi su 60-80 nanometara široki i 300-400 nanometara dugi). Zbog velike gustine ćelija, centrifugiranje je decenijama bila poželjna tehnika za primarno bistrenje. Međutim, čini se da su membranski procesi vrlo atraktivna alternativa jer je skalabilnost lako definirati.
Duboki filteri su efikasno korišćeni u nizvodnom procesu troslojnih čestica sličnih rotavirusu. Na laboratorijskom nivou, metoda ultracentrifugiranja gradijenta gustine CsCl se često koristi za pročišćavanje ovih složenih čestica. Istraživači su procijenili ne samo korak bistrenja dubokog filtera, već i cijeli nizvodni proces (cijepanje Triton X-100 i duboka filtracija, nakon čega slijedi ultrafiltracija i isključenje veličine čestica). Rezultati pokazuju da prinos gradijenta gustine CsCl može dostići 37%.
Ultracentrifugalna metoda je oko 10%. Kao drugi primjer, šuplja vlakna od 0,45 μm i vlakna finog promjera 500 kDa korištena su za obnavljanje i koncentriranje čestica sličnih HIV-u proizvedenih u ćelijama insekata. U ovoj studiji, posmična sila šupljih vlakana optimizirana je na osnovu integriteta ćelije. Rezultati Uspostavljen je proces niske sile smicanja kako bi se zamijenilo ultracentrifugiranje gradijenta stolnog šećera.
Proces ima potencijal da se primeni na masovnu proizvodnju. Duboki filteri su također uspješno korišteni u proizvodnji rekombinantnih adeno-povezanih virusa. Liza ćelija je izvedena mehaničkim ometačem ćelija sa dva klipa, nakon čega je usledio tretman nukleazom. U koraku bistrenja, korišten je dubok filter element od staklenih vlakana od 1,2 μm, a zatim dva sloja od 0, 8 μm hidrofilnog PES-a i 0, 2 μm hidrofilnog PES-a. Filteri proporcionalne veličine se koriste za procesne serije od manjih do 2{9}}0 L veličina. Duboki filteri su uspješno korišteni, a TFF ocjene sa ravnim filmovima ili šupljim vlaknima od 0,2 µm ili 0,45 µm su također prijavljeni kao vrlo učinkoviti.
Studija Tecnologica (IBET) na Institutu za eksperimentalnu biologiju Oeiras u Portugalu koristila je NFF za pojašnjenje hepatitisa C VLP-a izraženog bakulovirusima bez centrifugiranja. Nominalno ocijenjeni polipropilenski filteri (10,5,0.6 i 0.3μm) filteri se koriste za pojašnjenje sakupljanja VLP-a. Isti filteri sa ocjenom pora 0.6μm i 0.3μm koriste se za filtraciju u VLP centrima za prikupljanje. Svi proučavani filtrati su testirani na stope oporavka HCV-VLP i upoređene su preporučene metode filtracije. Rezultati su prikazani u tabeli 4.
Rezultati su pokazali da filter od 5μm-0.3μm ima najveći oporavak proizvoda (100%) za direktno sakupljenu VLP hranu za hepatitis C. Polipropilenski filter od 0,6 μm imao je najveći oporavak proizvoda (82%) za centralno napajanje, a klirens DNK ćelije domaćina bio je oko 70%.
2.2.1.4 Čestice slične virusu proizvedene u sistemima bakterija ili kvasca
Vrsta metode bistrenja za VLP vakcine izražene u bakterijskim ili kvasnim sistemima zavisi od oslobađanja VLP u ekstracelularne medijatore. Ako se VLP-ovi ne mogu efikasno lučiti, može biti potrebna liza ćelija ili drugi koraci ekstrakcije prije stvarnog koraka bistrenja. Iako je ovo zlatni standard u industriji bistrenja proteina, centrifugiranju (kontinuirano ili šaržno) izraženo u sistemima na bazi bakterija ili kvasca, u novije vrijeme, membranski procesi postali su vrlo atraktivna alternativa zbog svoje lakoće skalabilnosti i kompatibilnosti s jednokratnom upotrebom. tretmani.
Richter i Topell objašnjavaju upotrebu centrifugiranja, TFF-a ili njihove kombinacije kada se pripremaju VLP-ovi proizvedeni u pročišćenoj E. coli. U svom radu korišćene su 0.45m TFF membrane za razblaživanje i bistrenje homogenizovanih homogenata E. coli na temperaturi od 5 stepeni. Oni također primjećuju da je TFF na bazi membrane pogodan za rukovanje žetvama visokog viskoziteta, po mogućnosti korištenjem TFF jedinica sa konfiguracijom otvorenog kanala.
Centrifugalno bistrenje je također ocijenjeno kao alternativa TFF-u. U ovom slučaju, dobijeni homogenat nije razrijeđen i centrifugiran na 4 stepena 105 minuta, 10000g. Bez prenošenja meke prevlake, supernatant je izliven iz čestica i ponovo centrifugiran na 4 stepena i 10.000 g tokom 60 minuta. Supernatant je zatim uklonjen iz prisutnih čestica, razrijeđen sa EB puferom (43,89 mM Tris HCl, 6,11 mM Tris baze, 5,0 mM EDTA, 10% (v/v) Triton X-100) 1:2 i filtriran na sterilnom filter uređaju od 0,22 m. Dalja obrada. Proces povećanja za proizvodnju ove VLP vakcine u E. coli na skali od 800L također je navodno pojašnjen kombinacijom centrifugiranja i TFF.
Rekombinantna vakcina protiv hepatitisa E HEV 239 licencirana je u Kini za imunizaciju odraslih od 16 godina i više. Antigeni vakcine (VLP) su eksprimirani u E. coli, a pokazano je da je povećanje procesa proizvodnje antigena na skali od 50L. Produkt je ekstrahiran krekiranjem E. coli, a tijela inkluzije su odvojena od ćelijskih fragmenata običnim ispiranjem puferom koji sadrži 2% Triton X-100 i zatim otopljena u homogenizatoru 4 M uree. TFF pojašnjava VLP humanog papiloma virusa proizvedenog u Saccharomyces cerevisiae (15L). Ćelijski lizat tretiran nukleazom je bistren mikrofiltracijom unakrsnog toka u režimu transfiltracije koristeći filter od šupljih vlakana od 0,65 μm. Isti proces se koristi u proizvodnji vakcina. Iako je samo nekoliko vakcina zasnovanih na VLP-u dostiglo komercijalne razmere, nekoliko vakcina zasnovanih na VLP-u je u razvoju, od kojih je većina bistrena pomoću centrifugiranja ili membranske tehnologije.
Ograničeni uticajem prostora, drugu polovinu sadržaja ćemo podijeliti u sljedećem poglavlju. U sljedećem članku ćemo podijeliti neke slučajeve pojašnjenja vakcine i upotrebe relevantnih komponenti membrane.
Kao prva kompanija u krugu lokalizacije, Guidling Technology je akumulirala dovoljno relevantnog iskustva u razjašnjavanju vakcina. Guidling Technology je kompanija za razvoj i proizvodnju koja se fokusira na biofarmaceutsku i ćelijsku kulturu, prečišćavanje i separaciju. Proizvodi se široko koriste u biomedicini, dijagnostici, filtriranju industrijskih fluida, detekciji, bistrenju, pročišćavanju i procesu koncentracije; Guidling je uspješno razvio ultrafiltracionu centrifugirnu cijev, ultrafiltracionu/mikrofiltracijsku membransku kasetu, filter za uklanjanje virusa, uređaj za filter s tangencijalnim protokom, duboki membranski stog, itd., koji u potpunosti zadovoljavaju scenarije primjene biofarmaceutske i stanične kulture.
Naše membrane i membranski filteri se široko koriste u koncentraciji, ekstrakciji i odvajanju predfiltracije, mikrofiltracije, ultrafiltracije i nanofiltracije. Naša široka paleta proizvodnih linija, od male laboratorijske filtracije za jednokratnu upotrebu do sistema filtracije proizvodnog tipa, testiranja sterilnosti, fermentacije, ćelijske kulture i još mnogo toga, može zadovoljiti potrebe testiranja i proizvodnje.