Sažetak:

Ovaj članak pregledava dva ključna faktora koja se moraju uzeti u obzir u strategijama pročišćavanja proteina: zahtjevi za primjenom u nizvodno vrijeme i biološke karakteristike samih proteina. Članak naglašava da je visokokvalitetna pročišćavanje proteina temelj za pouzdanost i ponovljivost eksperimentalnih podataka, posebno za proizvodnju rekombinantnih proteina. Različiti scenariji aplikacija imaju specifične zahtjeve za čistoću proteina, aktivnosti ili endotoksina, a karakteristike proteina mogu značajno utjecati na strategije pročišćavanja. Prema specifičnim slučajevima, članak ilustrira da jedinstveni proteini trebaju usvojiti prilagođene sheme pročišćavanja. Konačno, predložen je sistematski proces proizvodnje proteina (slika 1), naglašavajući kontrolu kvaliteta kvalitete izbora izražavanja, dizajn izgradnje u optimizaciju pročišćavanja i preporučivanje evaluacije proteinskih homogenosti i funkcionalnosti kroz biofizičke tehnike (kao što su SECH-MALS, DSF, itd.). Ovaj članak ima za cilj pružiti praktične smjernice za istraživače, pomažući im da formuliše efikasne i operativne strategije pročišćavanja na osnovu karakteristika i zahtjeva za primjenu ciljnih proteina, poboljšavajući kvalitetu i efikasnost naučnih istraživanja.

 

Slika 1. Shematski dijagram procesa proizvodnje proteina

 

Proizvodnja proteina velike potražnje - Primjeri identifikacije problema, dizajn strategije ublažavanja i odgovarajući izlaz

 

1.Nucleinska kiselina vezanje na protein:

Prilikom pročišćavanja proteina koji veže nukleine kiseline potrebni su više koraka za uklanjanje kontaminacije nukleinske kiseline. Za vrijeme lize, nukleasta (poput SM nuklease (Benzonase®) ili DNAse ili Rnase) trebaju se dodati, ali vezane nukleinske kiseline ne mogu se u potpunosti ukloniti. Zamijenite korake uklanjanja nukleinskih kiselina, kao što su PEI ili Streptomicin sulfate padavine, pročišćavanje heparina ili hromatografije jona. Prisutnost nukleinskih kiselina nadgledala je omjer A26 0 nm \/ a28 0 nm tokom procesa pročišćavanja. Ako je omjer bio manji od 0,6, naznačio je da je čistoća proteina relativno visoka i onečišćenje nukleinske kiseline bilo je minimalno. Za proteine ​​sa snažno vezanim nukleinskim kiselinama mogu se privremeno denaturirati (poput tretiranja uree), a zatim rentaaturirani. Ključne točke: Koristite visokokvalitetne reagense, svježe tampone i čiste stupce (očistite sa 0,5m naoh prije upotrebe).

 

2. Miš feritinski teški lanac:

Svrha proizvodnje pročišćenog miša ferita teška lanac (MFTH1) protein je visoko rezolucija jedno-čestica krio-elektron mikroskopije (Cryo-em). Vektor za izraz Escherichia Coli kodirani neograničeni MFTH1 bio je ultrazvučno poremećen bez dodavanja bilo kakvog nukleana. Nakon zagrijavanja u 7 0 stepen, pretrpio je korake hromatografije, dijalizi i kromatografije dializi i veličine. Rezultirajući uzorak pokazao je prisustvo velike količine kontaminanata u slikama Cryo-Electron mikroskopije (slika 2a), koji je bio potpuno neprikladan za njegovu primjenu. Optimizirajte korake. Dodajte SM nuklease tokom procesa mobilnog liza i dijaliznog postupka nakon padavina amonijum sulfata, a zatim dodajte akcionarsku akcionarsku akciju za smanjenje omjera A26 0 Nm \/ A280NM od 1,4 do 0,8. Nakon veličine Izuzetna kromatografija, omjer a260nm \/ A280nm završnog uzorka MFTH1 iznosio je 0,56. SDS-stranica i Cryo-Electron mikroskopske slike (slika 2b) pokazale su da je protein bio vrlo čist, što ukazuje da su garani efektivno uklonjeni.

Slika 2 miša Ferritin teški lanac

 

 

 

3. Himnični protein Human DSRbec (DSRBD-EGF- Chimera):

DSRbec je formiran fuzijama dvostruko nasučena RNA obvezujućim domenom (DSRBD) ljudskih proteinskih kinaza i faktora rasta ljudskih epidermalnog (Hegf). Kad se DSRBD izraže u Escherichia Coli, pokazuje izuzetno visoku sposobnost vezivanja DSRNA. Nakon mobilne lise, ataminentna RNA ometat će obvezujući rekombinantne proteine ​​na kolonu s kromatografijom fiksne metalne jonke (IMAC). Konvencionalne metode kao što su Oborine PEI ili Streptomicin sulfate, Rnase tretman ili rešenja za tampon visoke soli ne mogu ukloniti RNA. Liza ćelije izvedena je pomoću pufera koji sadrži 4MUREU. Supernatant je učitao na stupac IMAC, a 4M do 0 m uree polako se koristi preko noći (rentaaturata stupca). Buffer renacijacije dodana je sa Imidazolom i eluirana iz stupca imac. Konačno useljenje izvedeno je putem Filtracije SuperDEX 75 gela kako bi se dobio funkcionalno aktivni DSRbec.

 

4 Proteini koji su vezan za divalentne katijske ili druge kofaktore:

Za proteine ​​koji komuniciraju s divalentnim kacijama kao što su Zn 2+, Cu {2+, ili drugi kofaktori, ključno je dodati specifične divalentne katione (ili druge kofaktore) tokom izražavanja. Tokom postupka pročišćavanja također je potreban mali iznos istih divalentnih kationa (ili drugih kofaktora). Međutim, mora se izbjeći upotreba bilo kojeg helantnog sredstava (poput EDTA, EGTA) i helat smanjuje sredstva za smanjenje (poput DTT-a ili DTT-a). Kada se bave proteinima vezanim za divalentne katije, mješavina inhibitora proteaze bez helantnih sredstava mora se koristiti za potvrdu stvarnog prisustva divalentnih kationa (ili drugih kofaktora) u pročišćenom proteinu kroz spektroskopopske metode (poput atomske apsorpcione spektrofotometrije).

 

. Rekombinantni feridoksin (RFD) koji sadrži jedan [2FE ± 2s] klaster iz termofilnih cijanobakterija mastigocladus laminosus

Ferridoxin je topljiv štit i željeznog sumpora koji sudjeluje u reakcijama prijenosa elektrona. Ferroroksin tipa biljaka nosi jedan [2FE ± 2S] kao elektronski akumulator fotostanacije I. Escherichia Coli BL21 (DE3) ESCOMBINAnt RFD proteina u TB mediju koji sadrži 10 mm FECL3 i antibiotike. Elumvanje stupca za snimanje IMAC-a izvedeno je pomoću tampon koji sadrži 10 mm histidin kako bi se izbjeglo imidazola i spriječiti uništavanje klastera [2FE ± 2S]. Anion razmjena i kromatografija isključenja veličine korištena su za daljnje pročišćavanje i koncentraciju na 12mg \/ ml za skrining kristalizacije. U usporedbi s rekombinantnom proizvodnjom Ferroroxina, prirodni feroroksin pročišćeni iz plavo-zelenog alga Mastigocladus Laminosus postigao je veću rezoluciju tokom kristalizacije.

 

6. Proteini koji se koriste kao antigeni

Proteini se često koriste kao antigeni za oporavak ligandi specifičnih za ciljanje. Prvo što treba uzeti u obzir je da li se proteini koristi u vivo imunitetu za dobivanje konvencionalnog monoklonalnog ili poliklona IgG-a, ili za programe koji uključuju CAMEL IGG ili procese odabira kamila ili in vitro.

 

6.1 Antigeni koji se koriste za rutinsko proizvodnju antitela

Kada se antigeni koriste za proizvodnju monoklonalnih Iggovih antitijela obično nije potrebna, jer većina monoklonalnih antitijela prepoznaje linearne epitope koje ne utječu na strukturu antigena, pa čak i denaturistički antigeni (poput inkluzije proteina tijela). Međutim, čistoća mora biti strogo kontrolirana kako bi se izbjeglo snažne imunogene kontaminante koji se miješaju u imunološki odgovor i uzrokujući dominaciju ne-ciljnih antitijela.

 

6.2 Pregled konjugirane biblioteke

Posebnu pažnju treba posvetiti održavanju prirodnog sukladnosti antigena tokom prerade biblioteke Nanobody dobivene imunizacijom kamile. Za razliku od konvencionalnih antitijela, antitijela za kamile (posebno nanobodije) teže prepoznati strukturne epitope, što je povezano sa njihovom jedinstvenom konveksnom komplementarnom strukturom mjesta. Slično tome, kad se probir u vitro-vitrojskog biblioteka ili prirodnog antitijela, Antigen mora održavati strukturu koja je u potpunosti u skladu s ciljanom aplikacijom. Budući da je sam proces screening ne pristrasan, ako antigen ima pogrešnu, agregiranje ili konformacijsku heterogenost, veliki broj konjugira koji ciljaju prirodne epitope može se prikazati.

 

 

 

7 Proteini koji sadrže intermolekularne ili intramolekularne disulfidne obveznice ili besplatni cisteine

Disulfidne obveznice su ključne za stabilizaciju prirodne strukture proteina. Tijekom postupka pročišćavanja, prilikom pročišćavanja proteina koji sadrže intermolekularne ili intramolekularne disulfidne obveznice, potrebno je izbjeći dodavanje smanjenja sredstava za sprečavanje konformacijskih promjena proteina, mijenjajući njihove funkcije. Za proteine ​​koji sadrže besplatan cistein, smanjujući agenti su neophodni u svim koracima postupka pročišćavanja, posebno za vrijeme skladištenja, kako bi se spriječilo stvaranje umjetnih disulfidnih obveznica. Najčešće korišteni sredstva za smanjenje su Dithiothreitol (DTT), -mercaptoetanol (-me) i tris ({2}} karboksietil) hidroklorid fosfina (TCEP). Za IMAC smole koji su nekompatibilni s DTT ili TTP-om, preporučuje se korištenje -me i zamijeniti ih drugim smanjujućim sredstvima u narednim koracima.

 

8. Fragment rekombinantnog antitijela

Iako je struktura fragmenata rekombinantnog antitijela (poput nanobodija) jednostavniji od onog IgG-a, njihova funkcija ovisi o ispravnom formaciji disulfidnih obveznica. U sistemima bakterijskih izraza, čak i uz usvajanje strategija optimizacije, ipak mogu doći do pogrešnih ili djelomično preklopljenih proizvoda, koji postoje i u topivom dijelu i u tijelu inkluzije. Više skrivenijih je da čak i pravilno preklopljeni fragmenti antitijela mogu formirati rastvorljive agregate (koloidne agregacije) kroz hidrofobne ploče na površini. Takvi agregati su teško identificirati u rutinskim funkcionalnim testovima (kao što su ELISA) jer multivalentni obvezujuće može maskirati pad afiniteta monomera, ali njihovo prisustvo može ozbiljno utjecati na aplikacije koje se oslanjaju na malu veličinu molekula (poput mikroskopije super rezolucije). Stoga se oslanjajući isključivo na SDS-stranici nedovoljno za procjenu kvalitete uzorka. Biofizičke metode kao što su gel filtracija (slika 3) moraju se usvojiti za razlikovanje monomera (glavnih vrhova) od agregata (vrhovi isključenja). Ključne kontrolne točke uključuju: optimiziranje Redox okruženja tokom izraza za promociju rasurnog obveznica i optimizacije uvjeta skladištenja nakon pročišćavanja za sprečavanje agregacije. Ove su mjere ključne za osiguranje monodistite i funkcije fragmenata antitela.

Slika 3. Gel filtracija odvajanje topljivih agregata nanobodija

 

9. Topiv fragmenti receptora limfocita LLT1

Rekombinantni izraz proteina koji ovise o disulfidnim obveznicama (kao što su limfocitni receptor LLT1) često se suočava s sklopivim poteškoćama. Gel Filtracija divljih tipa LLT1 pokazao je vrhove agregacije i dimer vrhove (slika 4a), ali masovna spektrometrija otkrila je pogrešne cistere uzrokovane neusporenim cisteinom u dimeru (slika 4b). U tu svrhu dizajnirana su dva mutanta: jedan je uklonio problem cisteine, što rezultira naglim padom prinosa (slika 4a); Nakon uvođenja neocisteina za rekonstruiranje suopćenog disulfidne veze, mutant nije imao samo visok prinos i dobru stabilnost, već bi mogla i kristalizirati (Slika 4C), a 3D struktura je potvrdila da mutant formira ispravnu disulfidnu vezu i održavala prirodno preklopljenje. Ovaj slučaj pokazuje da se racionalno dizajnirajući konformnim disulfidnim obveznicama, u kombinaciji sa gel filtracijom i analizom masovnih spektrometrije, može se dobiti preklopni problem rekombinantnih proteina, a mogu se dobiti funkcionalni proteini stabilnih konstrukcija i visoki prinosi.

Slika 4. Disulfidna obnavljanje obveznica poboljšava sklopivost i prinos rastvorljivih LLT1

 

 

 

10. Lako obrnuti proteini

Pročišćavanje rekombinantnih proteina često se suočava sa problemom agregacije, a njegova formacija slijedi mehanizam "rast nuklea" - mali iznos topivih agregata koji se prvo potakne u netopljivoj agregaciji velikih razmjera. Da bi se riješili strategije na više nivoa: u fazi izražavanja, to se može postići optimiziranjem soja, kojim se zadivljuju izrezujuće sustave i scordiraju (u okruženju za pročišćavanje (u okruženju od 4 stepena C) kako bi se izbjegla prekomjerna koncentracija proteina i "brzina pročišćavanja" i "brzo pročišćavanje" (kao što su direktna veza IMAC na sec) treba usvojiti da se odmah ukloni agregatno jezgra. Općenito govoreći, prilikom screening Buffer Solutions, faktori kao što su komponentni sastav, pH vrijednost, disocirajući agent ili solubilizator (slika 5). Kroz finu optimizaciju ortogonalnog otkrivanja (kao što su Sec, CD, LS, DSF i temperaturni pomak zasnovani na fluorescentnoj toplini, itd.), Utvrđeni su kvalitet proteina i najprikladnija pufer rješenja.

Slika 5. Strategije za ublažavanje združivanja proteina

 

11. Kristalizacija ljudske CLK1 Kinaze (kako dobiti reproducibilne serije)

Da bi se dobila homogena nefosforirana CLK1 Kinaza za proučavanje kristalizacije, usvojena je višestranačka suradnja shemom. Prvo, izraženo je sa λ -fosfatazom u Escherichia Coli kako bi se eliminirao heterogenost autofoshorije. Iako je prinos smanjen, osiguran je potpuna defosforilacija. Nakon što je uhvatio IMAC, eluentno je dopunjen stabilizatorima (50 mm arginin, 12 mm glutamske kiseline i 10 mm DTT) kako bi se spriječilo združivanje, koncentrirano, a njegova je oznaka uklonjena TEV probavom. Zatim je tačan oligomer odvojen Sec (koji sadrži 5% glicerola i -me). Konačni ključni stupanj aniona razlikuje se između kristalnog (ne-fosforiziranog) i nekristalne (djelomično fosforiklirane) CLK1 grupe. Posebno je vrijedno napomenuti da način ćelijske lize značajno utječe na stabilnost proteina - metoda visokog pritiska i visoke temperature dovodi do nepovratnog agregacije CLK1, ističući važnost blagog liječenja za pripremu Kinase.

 

 

 

12. Proizvedete Galectin -1 sa stabilnom sposobnošću vezanja za ligand

Za pripremu funkcionalnog galektina -1 za vezanje ligana, izraz i pročišćavanje strategija četiri konstrukcije (neoznačene i njegove označene divljine galektin -1, neoznačeni i mutantni Galectin "bez označenih cisteina. Ključni nalazi pokazuju da se pročišćavanje kromatografije laktozne afinitet može učinkovito zaslona za pravilno preklopljene proteine, ali treba se kombinirati s temeljnom dijalizom (HEPES pufer) kako bi u potpunosti uklonila laktozu sa obveznica i obnavljaju CRD aktivnosti. Galectin divlji tipa -1 sklon je oksidaciji i inaktivaciji, a njena stabilnost ostaje ograničena čak i u prisustvu sredstava za smanjenje (slika 6). Međutim, mutant bez cisteina značajno povećava dugoročnu stabilnost uz održavanje uporedivog aglutinacijske aktivnosti i toplotnu stabilnost (Verificirani od strane Nanodsf, ITC, itd.) Eliminacijom ovisnosti o disulfidnoj vezi.

Slika 6.. Hidrodinamička karakterizacija rekombinantnog galektina -1 otkriva svoju nestabilnost

 

13. Endotoksinsko uklanjanje

Metoda uklanjanja endotoksina zasnovana je na hromatografiji afiniteta, uključujući pozitivno nabijenu kromatografiju (anionska razmjena), upotreba polikacijskih ligandi (poput poli-l-lizina (PLL), imobilizirani poliamin (polimimizin b)) i dodavanje surfaktantnih antina x -114. Tijekom postupka pročišćavanja obratite pažnju na pripremu pufernog rješenja sa vodom bez LPS-a i koristite nove stupce ili stupce koji su korišteni samo u ostalim pročišćavanjem LPS-a. Za kontaminaciju endotoksina, kromatografska pumpa \/ tekući sistem može se inkubiti preko noći u 0. 5m naoh ili 4 sata u 1. 0 m naoh. Konačna količina LP-a u uzorku ocijenjena je korištenjem Limulus Amebocite Lysate Reagent (LAL), a potvrđeno je je li to bilo ispod granice potrebne za određenu aplikaciju.

 

14. Proteinski kompleks

Izraz i pročišćavanje proteinskih kompleksa potrebno je optimizirati u skladu s posebnim uvjetima. Izazovi uključuju nestabilnost ili pogrešnu pojasu podbojnica. Svaka podjedinica može se izraziti nezavisno i sastavljena in vitro ili su izrazila za formiranje funkcionalnih proteinskih kompleksa. Građevinski dizajn treba pažljivo uvesti s naljepnicama za pročišćavanje ili otkrivanje kako bi se izbjeglo da se miješa u sklop, posebno kada su složene informacije ograničene i potrebne su više optimizacije. Tokom procesa pročišćavanja, integritet i stabilnost kompleksa trebaju se procijeniti. Metode uključuju SDS-stranicu (detekcija subunova), sec (homogenost), sec-mus (analiza molarne mase), masovna fotometrija ili prirodna masovna spektrometrija (verifikacija mase). Treba napomenuti da se kompleks može odvojiti u niskim koncentracijama. U ovom trenutku, hromatografska metoda ili tampon (kao što je kroz termički drift ili DSF probirske uvjete) treba optimizirati. Nadalje, smanjujući korake pročišćavanja može spriječiti gubitak slabih interakcijskih podjedinica i uravnotežiti efikasnost pročišćavanja i integritet kompleksa.

 

 

 

15. Pročišćavanje kompleksa antigena-antitijela

Antibod-antigen Kompleksi su tipični primjeri proteinskih kompleksa. Njihova koprojzallizacija može otkriti obvezujuće obrasce i voditi optimizaciju inženjerstva antitegara. Tradicionalne metode zahtijevaju odvojeno pročišćavanje antigena i antitijela, a zatim ih miješaju. Međutim, nedavne studije su pokazale da su strategije izraze i ko-pročišćavanja efikasnije. Potrebno je samo jedno pročišćavanje za dobivanje kompleksa, a istovremeno se nestabilni antigeni mogu stabilizirati kroz antitijele, a čak se može postići i izraz bez etiketa. U ovoj specifičnoj situaciji, SDS-stranica i gel filtracija (SEC) obično su dovoljni za procjenu čistoće i kvalitete kompleksa.

 

Sažetak

Pročišćavanje proteina je temeljna tehnologija u naučnom istraživanju. Proizvodnja proteina akademske razmjere obično slijedi standardne strategije i može proizvesti visokoprostornu visoku čistoću, rastvorljive proteine ​​koji se široko koriste u strukturnoj biologiji, biohemiji i funkcionalnoj istraživanju. Međutim, posebni zahtjevi za nizvodne aplikacije (poput potrebe za endotoksinom u životinjskom eksperimentu i nema nukleinske kiseline istraživanja) ili urođene karakteristike proteina (poput lakog združivanja, koji sadrže disulfidne veze ili visoke nukleinske asocijalnosti) često zahtijevaju prilagođena rješenja. Ovaj pregled, kao odgovor na ove posebne okolnosti, predlaže rafinirane strategije u rasponu od izbora izraza, dizajn konstrukcija (optimizaciju etiketa i granica domena) u proces pročišćavanja i uvođenje kontrole kvalitete (kao što su Sec, SDS-stranica, otkrivanje aktivnosti itd.) Na ključnim koracima. Neke aplikacije također zahtijevaju dodatnu analizu (kao što su endotoksinska detekcija i određivanje ostataka nukleine kiseline), slično konceptu "osiguranja kvaliteta" (QA) u biofarmaceutičkoj industriji, odnosno kako bi se spriječilo nedostatke kroz sistematske procese. Formuliranjem konkurentskih smjernica i razjašnjenja specifičnih standarda za reagense proteina koji se koriste u naučnim istraživanjima, cilj je uspostaviti stroge normalne norme za pročišćavanje proteina za akademske laboratorije, poboljšati razliku i most pojas između osnovnih istraživačkih i industrijskih standarda.

 

Doi: 10.1186 \/ s {2}}