Podijeli u literaturi|Pozdraviti se za složeno pročišćavanje? Metoda proseknog držanja Novel TFF + poboljšava efikasnost i smanjuje troškove u proizvodnji AAV vektora
Genska terapija se brzo razvija, a ipak njezini visoki troškovi ostaje velika barijera koja sprečava širi pristup pacijentu. Među ključnim pokretačima ovog troška je složen proces proizvodnje Adeno - vektora pridruženog virusa (AAV). Studija objavljena u biotehnologiji i bioinžinjeringu razvila je roman metodu pročišćavanja koji kombiniraju tangencijalni protočni filtriranje (TFF) sa površinskim aktivnim aktivnim tvarima, što obećava da će pojednostaviti proces pročišćavanja AAV-a i smanjenje troškova. Razgovarajmo u ovo istraživanje koje je vodila tim sa Univerziteta u Tokiju.
1. Istraživačka pozadina: izazovi i trenutni status pročišćavanja AAV-a
AAV vektori postali su alati za dostavu "zvezda" u genskoj terapiji zbog velike sigurnosti, male imunogenosti, sposobnost da zaraze i podjele i ne - razgraničene eizmiju. Međutim, njihov proizvodni proces je složen, posebno koraci pročišćavanja nizvodno, koji obično uključuju više rundi centrifugiranja i kromatografije. Ove metode su vrijeme - konzumiranje, rad - intenzivno, teški za razmještanje i skupo.
U laboratorijskoj skali, pročišćavanje se često oslanja na cezijum-klorid ili gradijent gustoće i Iodxanol, koji je izazovan za razmjenu industrijske proizvodnje. Kromatografija afiniteta se sve više koriste, ali niski pH elupski uvjeti zahtijeva može narušiti virusnu infektivnost. Stoga je razvijanja jednostavne, efikasne, nježne i skalabilne metode pročišćavanja AAV-a kritična.
Tangencijalna filtracija protoka (TFF) je veličine za razdvajanje na bazi - koja se temelje na koncentraciji i međuspremnika - razmjenu bioprodukata. Međutim, konvencionalni TFF ima ograničenu sposobnost uklanjanja nečistoća poput proteina host-ćelija (HCP) i DNK tokom pročišćavanja AAV-a, koji stoje iza sebe.
2. Inovativni pristup: TFF u kombinaciji sa površinskim aktivnim aktivnim aktivnim aktivnostima za efikasno pročišćavanje
Da bi prevladao ograničenja tradicionalnog TFF-a, Yuji Tsunekawa, Yuji Tsunekawa, i kolege na Univerzitetu u Tokiju osmislili su surfakte za inhibiranje agregacije i interakcije prolaze kroz ultrafiltracijsku membranu (od 500 kDA molekularne rezone) dok se zadržavaju AAV virusne čestice (~ 25 nm u veličina).
Testirali su tri vrste površinski aktivnih aktivnih znakova:
- Ne - Jonsko:Octyl glukoside
- Anionsko:Natrijum deoksiholat
- Zwitterionic:Praznine
Studija je utvrdila da je korištenje ne {{- jonski surfaktant bio neefikasan. I anioninski natrijum-deoksiholat i ZwiterIonic potječe značajno poboljšavaju uklanjanje preostalih proteina, a ciljali su različite populacije proteina. Konačno, kombinirajući 0,5% natrijum deoksiholat sa 1% tragova proizveli su izvanredne rezultate, gotovo u potpunosti eliminirajući preostale proteine domaćina. SDS - Analiza stranice pokazala je samo tri čista AAV CAPSID proteinske opsege (VP1 / VP2 / VP3).
Slika 1. Proces pročišćavanja TFF bez surfaktanata;(a) SDS - gel stranica elektroforeza; (b) Mikroskopija elektrona za prijenos (TEM)
Slika 1. Proces pročišćavanja TFF-a sa površinskim aktivnim aktivnim aktima;(a) SDS - Gel stranica sa stranicama stranica; (b) Transmisija elektronska mikroskopija (TEM)
3 Rezultati istraživanja: visoka čistoća, aktivnost i sigurnost
- Učinkovit uklanjanje nečistoća:Nova metoda postignuta 99,98% uklanjanja HCP-a i 95% uklanjanja DNK, čistoćom uporediv sa ili prekoračenjem kromatografije afiniteta.
- Poboljšana infektivnost:IN vitro eksperimenti pokazali su da je vektori AAV-a pročišćeni koristeći ovu metodu zaražene HEK293 ćelije efikasnije od onih pročišćenih kromatografijom afiniteta (24,9% vs 20,8%), što ukazuje na bolje očuvanje virusne bioaktivnosti.
- Dobro u vivo sigurnosti:Nakon lokalnog ubrizgavanja pročišćenih aav1 vektora u mišić za skelet miša, nije bilo značajno oštećenje upale ili tkiva nakon dvije sedmice, pokazujući dobro u Vivo sigurnosti.
- Široko serotip primjenjivost:Metoda uspješno pročišćena više serotipa - uključujući AAV1, AAV5, AAV8 i AAV9-iz supernatanta kulture ćelije. Međutim, za AAV2, koji uglavnom postoji u ćelijskim lizi sa visokim opterećenjem nečistoće, potrebna je daljnja optimizacija.
4. Sažetak i izgledi
Ova je studija razvila jednostavan, brz (1,5 sati), efikasan i skalabilan novi AAV postupak pročišćavanja. Kombinacijom natrijum-deoksiholata i mozda, uspješno se bavio izazovom zaostale opredijeljenih proteina tokom pročišćavanja TFF-a.
Prednosti metode uključuju:
- Izbjegavanje oštrih uvjeti pH, bolje očuvanje virusne aktivnosti
- Smanjenje koraka kromatografije, pojednostavljujući tijek rada i štedeći vrijeme i troškove
- Jednostavno skalabilno, pogodno za industrijsku proizvodnju šire -
- Pružanje nove strategije za pročišćavanje drugih biomakromolekula kao što su egzozomi, ostali virusi i rekombinantna antitijela
Trenutna ograničenja uključuju suboptimalni virusni oporavak i nemogućnost za odvajanje praznih kapsa iz punih virusnih čestica, što sugerira da je njegova najbolja upotreba možda kao prvo - korak koraka u multi - tijeku pročišćavanja.
Zaključno, ovo istraživanje nudi atraktivnu novu opciju za nizvodno AAV vektorsku proizvodnju i ima potencijal da značajno smanji troškove lijekova genskih terapije, olakšavajući njihovu širu primjenu.