Kako odabrati odgovarajuću ultrafiltracijsku cijev
Ultrafiltracione cijevi koje se obično koriste za koncentraciju proteina i zamjenu bafera često se koriste u ultrafiltracionim cijevima. Postoje i drugi modeli, koji imaju različite veličine volumena i ultrafiltracione cijevi, u zavisnosti od molekularne težine ciljnog proteina, volumena prije koncentracije i ciljnog volumena koncentracije. Za više od 1000 dolara.
1. Odaberite pogodan ultrafiltracijsku cijev, uglavnom uzimajući u obzir MWCO i volumen koncentracije. Općenito, molekularna težina ne bi trebala biti veća od 1 / 3 molekularne težine ciljnog proteina. Ako je molekularna težina ciljnog proteina oko 10 kd, može se koristiti ultrafiltracijska cijev sa zadržati molekularnom težinom od 3 KD.
2. Novokupljena ultrafiltracija je suha. Dodajte miliq vodu prije upotrebe. Voda u potpunosti prolazi kroz membranu i prekuvana je u ledenom kupatilu ili hladnjaku nekoliko minuta. Zatim izlijte vodu da dodate rastvor proteina. Količina otopine proteina ne prelazi bijelu liniju na vrhu epruvete. Laka operacija. Prije dodavanja otopine proteina, ultrafiltracijsku cijev treba umetnuti u led za pre hlađenje.
3. Ravnoteža. Masa i centar gravitacije moraju biti uravnoteženi. Imajte na umu da brzina i ubrzanje ne bi trebali biti prebrzi, inače će ultrafiltracijska membrana biti direktno oštećena. Počnite centrifugalnu ultrafiltraciju (precooling the centrifuge to 4 degrees). Smjer dijafragme i rotirajućeg otvora može se podesiti prema uputama (u slučaju centrifuge kuta dijafragma je okomita na okno). U stvarnoj upotrebi, opća brzina je niža od navedene u priručniku, što može produžiti životni vož centrifugalni cijev.
4. kada se koncentriše na preostalih 1ml, [uzmite 50ul kućanstvenu Bradford otopinu, dodajte 10ul tekućine da vidite da li će poplaviti, i utvrditi da li ultrafiltracijska cijev curi iz proteina. Ako cjevčica curi, sipajte je u gornji sloj i zatim se vratite u novu cijev kako biste počeli ultrafiltraciju. Da bi se tačno utvrdilo da li epruveta curi, molimo vas 5mg 10min centrifuge 10min, zatim ga prođite, prođite proteinski gel ili Bradford] [mjerenje nabora]. Nastavite sa dodavanjem preostalog rastvora proteina da se koncentrirate (radite na ledu kako bi se spriječilo zagrijavanje proteina) dok se ne dodaju svi koncentrirani rastvori. Tokom centrifugacije obratite pažnju na to da li dolazi do padavina proteina i uzrokuje blokadu cijevi. Ako dođe do padavina, molimo vas da odredite specifičan uzrok padavina, da li je koncentracija proteina previsoka ili je bafer neprikladan; Bivša se može riješiti korištenjem više ultrafiltracionih cijevi u isto vrijeme kako bi se smanjila koncentracija, dok ovaj drugi može mijenjati različite pufere dok protein ne pada.
5. Prethodni koraci se koriste za koncentrat proteina. Ako će se međuspremnik zamijeniti, Kada je totalna otopina proteina koncentrirana na oko 1ml, lagano dodajte novi međuspremnik (ultrafiltracija kroz 0,22um ultrafiltracijsku membranu), a zatim se neprekidno koncentrišite na oko 1ml tri puta, tako da konačna koncentracija zavisi od potrebne koncentracije proteina, što obično nije više od 500ul ili manje od 200ul. Prema koncentraciji volumena od najmanje 10 puta svaki put, to je više od 1000 puta više od tri puta, što u osnovi može postići svrhu promjene bafera.
6. Uklonite koncentrat konačnih proteina. Operiši na ledu. Koristeći žuti vrh pipete (200ul), lagano umetnite vrh pipete duž ruba, a zatim lagano pušite i pomiješajte otopinu proteina. Pazi da ne diraš ultrafiltracijsku membranu. Sisajte koncentrirano rješenje na 200ul svaki put dok se potpuno ne usisa. Nije potrebno izdvajati posljednju koncentriranu otopinu na dnu epruvete, inače je previše teško i ultrafiltracijska membrana može biti oštećena. Konačno, miliq voda se dodaje u ultrafiltracijsku cijev bez prolaska kroz membranu ultrafiltracije kako bi se spriječilo gubitak vode i sušenje membrane.
7. Slijede koraci za liječenje ultrafiltracijsku cijev i reusibu ultrafiltracijsku cijev.
8. Ulijte vodu u cijev za ultrafiltraciju i nježno isperite miliq vodom nekoliko puta. [ako postoje očigledne padavine proteina na dnu epruvete, možete prvo dodati vodu, a zatim je oduvati pipetama. Pazi da ne diraš membranu. Sediment visi dolje i onda bježi. Ne možeš ga pustiti vodu iz slavine. Nakon dodavanja 0,2m NaOH otopine, 20 minuta ga posjecite na 20 minuta i uravnotezite ultrafiltracijsku cijev u tom periodu. Centrifuga još 10 minuta. Izlijte preostali NaOH rastvor i uranjajte jezgru pamuka u vodu za pivo (1 ili 2L) Milliq, stavimo nekoliko sati, a zatim zamijenite novom vodom, stavimo nekoliko sati da kontinuirano razrijedi koncentraciju NaOH-a. 50ml epruvetu 50ml i pokrijte vodom iz slavine, te unutrašnji zid ogulite miliq vodom.
9. Izvadite uronjenu jezgru epruvete, dodajte je u punu miliq vodu, a zatim napunite epruvetu od 50ml miliq vodom. Polako stavite jezgru cijevi u 50ml.
Centrifugna cijev, odvodi i podijeli vodu, pa pokrij i čuvaj na 4 stepena do sljedeće upotrebe. Općenito govoreći, prema gorenavodećem koraku i predostrožnosti, svaka cijev se neće slomiti u roku od tri ili četiri godine.