Nizvodni proces ultrafiltracije/dijafiltracije: Kako učinkovito spriječiti prodiranje i gubitak ciljnog proteina

Nizvodni proces koncentracije ultrafiltracije/dijafiltracije: Kako efikasno spriječiti prodiranje i gubitak ciljnog proteina

U nizvodnim procesima prečišćavanja rekombinantnih proteina, krvnih proizvoda i drugih bioloških preparata, ultrafiltracija/dijafiltracija (UF/DF) se koristi za koncentraciju sirovine, razmjenu pufera i uklanjanje soli i malih-nečistoća molekula. Razdvajanje se postiže membranskim prosejavanjem: veliki molekuli kao što su monoklonska antitijela (mAbs) se zadržavaju u membrani, dok soli, endotoksini, slobodni proteini ćelije domaćina (HCP) i druge nečistoće malih{2}}molekula prolaze kroz membranu i uklanjaju se u permeatu. Tokom povećanja procesa-, gubitak ciljnog proteina kroz membranu može se lako dogoditi, direktno smanjujući prinos i povećavajući troškove serije. U nekim radnim uslovima, protein se može otkriti u permeatu, što zahteva brzo određivanje da li su iscurele komponente intaktno ciljno mAb, degradirani/fragmentirani agregati ili proteini ćelije domaćina. Ovaj članak je podijeljen u dva glavna dijela: razmatra tradicionalne pristupe-kontroli procesa i, u kombinaciji sa dizajnom eksperimenata (DOE), uspostavlja robustan prozor procesa, podržan višestrukim analitičkim metodama za određivanje identiteta proteina otkrivenih u permeatu.

 

 

I. Ključni uzroci prodiranja ciljnog proteina kroz membranu tokom UF/DF

1. Prekomjerni transmembranski pritisak (TMP)
Kada je razlika tlaka na membrani previsoka, otpor rastvarača se povećava, prisiljavajući dio monomernog proteina u permeat. Tokom povećanja-naviše, rezervoar za punjenje sadrži veću zapreminu materijala i fluktuacije pritiska u cjevovodu su izraženije, što čini prolazni nadpritisak vjerovatnijim nego u laboratorijskoj skali.

2. Nepravilan tangencijalni protok
Ako je brzina protoka preniska, na površini membrane se formira gust koncentracijski-polarizacijski sloj, a lokalna koncentracija proteina može premašiti prag tolerancije membrane. Ako je brzina protoka previsoka, napon smicanja može uzrokovati strukturno cijepanje mAb, stvarajući manje fragmente proteina koji mogu slobodno proći kroz pore membrane.

3. Previše visoka koncentracija proteina u sirovini
Kada je koncentracija proteina u hrani previsoka, protein se akumulira na površini membrane, a dio monomernog proteina može se prenijeti u permeat. Ovo je čest problem u velikoj-produkciji.

4. pH ili provodljivost izvan opsega procesa
Promjene u karakteristikama naboja proteina mogu smanjiti njegov radijus hidratacije i prividnu veličinu čestica, što rezultira abnormalnom permeacijom membrane.

5. Starenje membranske kasete, visok difuzni fluks ili nedovoljno prethodno{1}}kondicioniranje
Fizički defekti u membranskoj kaseti mogu direktno uzrokovati curenje proteina i predstavljati rizik u vezi s opremom. Ponovljeni CIP sa jako alkalnim rastvorima može postepeno oštetiti materijal polietersulfonske (PES) membrane.

6. Prevelik volumen dijafiltracije
Tokom produžene dijafiltracije, kontinuirano ispiranje rastvaračem može postepeno odnijeti male količine monomernog proteina.

 

II. Tradicionalne praktične mjere za sprječavanje prožimanja i gubitka ciljnog proteina

(A) Kontrola parametara procesa

1. Kontrola transmembranskog tlaka (TMP)
Definirajte gornju granicu upozorenja o pritisku i uspostavite alarme blokade kako biste spriječili prolazne utjecaje visokog{0}}pritiska na sloj membrane. Nakon određivanja osnovnih parametara na maloj skali, smanjite siguran radni pritisak tokom proizvodnje-naviše i zadržite odgovarajući raspon tolerancije procesa.

2. Optimizirajte poprečni protok
Uspostavite stabilan granični sloj i smanjite polarizaciju koncentracije na površini membrane kroz unakrsno strujanje, čime se minimizira akumulacija proteina na površini membrane na izvoru.

3. Ograničite konačnu koncentraciju nakon koncentracije
Definirajte granicu koncentracije na osnovu fizičko-hemijskih svojstava proteina i izbjegavajte prekomjernu koncentraciju hrane. Za mAbs, rutinska konačna koncentracija općenito ne prelazi 50 mg/mL; za neke mAbs{2}}sklone agregaciji, koncentraciju treba dalje smanjiti.

4. Kontrolirajte pH i provodljivost hrane
Održavajte stabilnu veličinu hidratiziranih čestica proteina i izbjegavajte molekularnu kontrakciju uzrokovanu poremećajima kiselinske/bazne ili jonske{0}}snage.

(B) Oprema i operativne kontrole

1. Izvršite ispitivanje integriteta membranske kasete prije svake serije
Izvršite test sa mjehurićem{0}}prije proizvodnje svake serije kako biste identificirali slomljena membranska vlakna. Oštećene membranske kasete treba odmah baciti kako bi se spriječilo kontinuirano curenje proteina.

2. Standardizirajte proceduru CIP čišćenja
Kontrolirajte koncentraciju NaOH i vrijeme kontakta. Nakon jako alkalnog čišćenja, potpuno uravnotežite materijal membrane kako biste smanjili rizik od deformacije pora membrane.

3. Koristite stepenastu dijafiltraciju
Koristite razmjenu pufera velikog-volumena tokom rane faze da uklonite soli i usporite protok dijafiltracije kako se krajnja tačka približava kako biste smanjili otpor i gubitak proteina.

 

III. Uspostavljanje prostora za dizajn procesa kroz DOE (QbD karakterizacija procesa; primjenjivo na IND podnošenje)

1. Faktorski skrining
Pregledajte pet ključnih parametara procesa UF/DF (P): transmembranski pritisak, brzina protoka hrane, početna koncentracija proteina, pH hrane i radna temperatura.
Varijable odgovora: zadržani prinos, sadržaj proteina u permeatu, fluks membrane i postotak agregata visoke{0}}molekularne{1}}težine.

Kroz analizu značaja, identifikujte ključne faktore koji doprinose curenju proteina.

2. Modeliranje površine odziva
Odaberite četiri parametra s najvećim značajem da biste konstruirali površinu odgovora i analizirali interakcije između parametara. U mnogim radnim uslovima, jedan parametar može ostati unutar svog kvalifikovanog opsega, dok kombinacija dva parametra može dovesti do prodiranja proteina. Takvi efekti interakcije ne mogu se identificirati kroz tradicionalne-faktorske-po{4}}eksperimente-. Na osnovu modela definirajte operativni prostor za dizajn. Sve dok parametri procesa ostaju unutar ovog raspona, može se osigurati efikasno zadržavanje proteina dok se nečistoće uklanjaju dijafiltracijom.

3. Najgori-izazov (potreban za karakterizaciju procesa)
Odaberite procesne parametre na krajnjim granicama rada kako biste simulirali varijabilnost proizvodnje: maksimalni TMP, minimalna brzina protoka i gornja-granična koncentracija proteina. Provjerite da čak i pod ekstremnim radnim uvjetima ne dođe do velikog-gubljenja ciljnog proteina, čime se ispunjavaju zahtjevi CMC pregleda.

 

IV. Višestruke analitičke metode za identifikaciju proteina otkrivenih u permeatu i razlikovanje ciljnih mAb, degradacijskih fragmenata i HCP

Na osnovu analitičke efikasnosti, troškova i scenarija podnošenja propisa, metode se mogu podijeliti u dvije kategorije: brzi skrining i potvrdno testiranje. Brze metode treba dati prioritet za rutinsko praćenje procesa; kada se pojave abnormalna odstupanja, treba koristiti precizne metode identifikacije.

1. UV spektrofotometrija (brzi online skrining; poželjno za rutinsko praćenje dućana-poda)
Sakupite permeat i izmjerite njegovu apsorpciju A280. Ovo samo može utvrditi da li je protein prisutan u permeatu i ne može razlikovati vrste proteina. Uglavnom se koristi za rutinsko praćenje procesa. Kontinuirano povećanje vrijednosti A280 ukazuje na pogoršanje curenja proteina i zahtijeva hitnu obustavu dijafiltracije i ispitivanje procesa.

2. SDS-PAGE elektroforeza (najčešće korištena kvalitativna metoda identifikacije)
Koristite redukujuću i ne{0}}reducirajuću elektroforezu i uporedite pozicije traka sa onima ciljnog mAb u sirovini:
1) Ako je pozicija trake potpuno konzistentna sa ciljnim mAb, intaktno mAb je proželo membranu.
2) Ako se pojave trake niže-molekularne-težine, protein je podvrgnut hidrolitičkom cijepanju, stvarajući fragmente mAb.
3) Ako su trake raštrkane sa više različitih traka, većina su proteini ćelije domaćina (HCP) iz E. coli/CHO ćelija domaćina, a ne ciljni proizvod.

3. hromatografija visoke{1}}veličine{2}}isključivanja (HPSEC)
Odvojite komponente prema veličini molekula i uporedite njihova vremena eluiranja s onima na kromatogramu sirovine:
- Glavni pik sa istim vremenom zadržavanja kao mAb ukazuje na intaktni ciljni protein.
- Vrh koji je ranije eluiran ukazuje na agregate/fragmente velike{1}}molekularne-težine.
- Vrh koji se kasnije eluira ukazuje na fragmente degradacije niske{1}}molekularne-težine.
- Odsustvo karakterističnog glavnog pika ukazuje na proteine ​​nečistoće HCP.
Ova metoda može pružiti kvantitativne podatke i može se uključiti u izvještaje o istrazi odstupanja procesa; visoko je prihvaćen u kliničkim materijalima za podnošenje.

4. ELISA komplet za testiranje proteina ćelija domaćina-HCP
Ako se protein otkrije u permeatu, rezultat ELISA je povišen, a HPSEC ne pokazuje karakteristični pik mAb, može se u osnovi utvrditi da je procureli materijal CHO domaćin-ćelijski protein. Ovo ukazuje na nepotpuno uklanjanje nečistoća tokom prethodnog prečišćavanja; nečistoće se ispiru tokom UF/DF faze i ne predstavljaju gubitak proizvoda.

5. Provjera afinitetne hromatografije (protein A hromatografija)
Protein A specifično vezuje Fc region mAbs. Ubacite uzorak permeata na kolonu: pojava karakterističnog eluacionog vrha ukazuje na prisustvo intaktnog ciljnog antitela; odsustvo pika elucije pokazuje da su svi proteini u permeatu proteini nečistoće.

6. Masena spektrometrija (LC-MS) (dubinska sljedivost; koristi se za istraživanje velikih odstupanja procesa)
LC-MS može direktno analizirati sekvencu aminokiselina i precizno odrediti porijeklo proteina. Uglavnom se koristi za ispitivanje teških ili neobičnih odstupanja i ne koristi se kao rutinski u-testovima kontrole procesa.

V. Korektivne radnje koje odgovaraju različitim analitičkim rezultatima

1. Intaktno ciljno mAb detektovano u permeatu
Smanjiti transmembranski pritisak i konačnu koncentraciju nakon koncentracije; suziti radni opseg procesa na osnovu rezultata DOE; i provjerite integritet membranske kasete.

2. Fragmenti degradacije antitijela otkriveni u permeatu
Istražite naprezanje na smicanje tokom cijelog procesa i ekstremne pH vrijednosti; optimizirati korak uzvodne inaktivacije virusa kako bi se smanjilo cijepanje proteina.

3. Samo proteini HCP nečistoće otkriveni u permeatu
Nije potrebno podešavanje UF/DF parametara. Pratite problem do prethodnih koraka hromatografije i poboljšajte uklanjanje nečistoća tokom hromatografije afiniteta i jonske{1}}izmjene.

 

VI. Rezime

Kako bi se spriječilo curenje proteina tokom UF/DF, tradicionalna kontrola procesa se oslanja na istorijsko iskustvo za definiranje pojedinačnih parametara tačaka, koji mogu samo na adekvatan način riješiti stabilnu proizvodnju malih{0}}razmjera. Da bi se osigurale stabilne performanse tokom postupnog povećanja procesa-naviše, karakterizacija procesa zasnovana na DOE-trebalo bi se koristiti za uspostavljanje prostora za projektovanje procesa sa dovoljnom tolerancijom. Kontrola parametara zasnovana na intervalima može kompenzirati varijabilnost proizvodnje. Jednom kada se protein otkrije u permeatu, jednostavan sistem UV detekcije može pružiti početno upozorenje, nakon čega slijedi elektroforeza, HPSEC i ELISA za praćenje i identifikaciju. Ovo omogućava preciznu diferencijaciju između ciljnog proizvoda i nečistoća u ćelijama domaćina, omogućavajući ciljano istraživanje korijenskog-uzroka i korektivne radnje. Ovo je također standardizirana istraživačka komponenta koja je trenutno uključena u CMC dokumentaciju za mAb projekte.