Kratka rasprava o nekoliko jedinstvenih metoda šupljih vlakana u prečišćavanju inkluzijskog tijela

Inkluzijska tijela (IB) su čestice netopivih proteina visoke gustoće umotane u membrane nastale kada se strani geni eksprimiraju u prokariotskim stanicama, posebno u Escherichia coli. Kada se posmatra pod mikroskopom, IB je područje visoke refrakcije, koje se očigledno razlikuje od ostalih komponenti u citoplazmi.

Formiranje inkluzijskih tijela je relativno složeno, povezano sa brzinom proizvodnje proteina u citoplazmi, koncentracija novogenerisanih peptida je visoka, a nema dovoljno vremena za savijanje, kako bi se formirali amorfni proteinski agregati. Inkluzijska tijela su u osnovi sastavljena od proteina, od kojih su više od 50% klonirani proizvodi. Primarna struktura ovih proizvoda je potpuno ispravna, ali je trodimenzionalna konfiguracija pogrešna, tako da nema biološke aktivnosti. Veličina tijela inkluzije je 0.5-1 μm, nerastvorljivo u vodi, rastvorljivo samo u denaturantima kao što su urea, gvanidin hidrohlorid, itd.

U E. coli, inkluzijska tijela se mogu pojaviti na dvije lokacije ćelije: citoplazmi i perifernoj citoplazmi. Lokacija i karakteristike inkluzijskih tijela u ćeliji zavise od toga kako se proteini eksprimiraju.

Inkluzije u citoplazmi E. coli se uglavnom kreću u prečniku od {{0}}.2 do 1,5 μm, a različiti proteini imaju različite prečnike, kao što je veličina interferona 0,811 μm, a veličina prorennet je 1.281μm. U nekim slučajevima, promjer nekih inkluzijskih tijela je veći od prečnika E. coli, što daje E. coli izbočinu. Općenito, ćelija ima samo jedno inkluziono tijelo.

 

Pročišćavanje inkluzijskog tijela

 

Proces pročišćavanja inkluzijskog tijela općenito je:

drobljenje ćelija:

Opšta tehnologija drobljenja ćelija je: brzo drobljenje tkiva, homogenizacija staklenog homogenizatora, ultrazvučna obrada, ponovljena metoda zamrzavanja-odmrzavanja, hemijska obrada (uglavnom korišćenjem tretmana lizozimom).

 

Inkluzija za pranje tijela:

Inkluzijska tijela su neaktivne čvrste čestice nastale intracelularnom aglutinacijom proteina koje eksprimiraju bakterije, koje obično postoje u amorfnom, netopivom obliku. U inkluzijskom tijelu, pravi ciljni protein čini samo oko 50%, a ostatak sadrži lipide, lipopolisaharide, nukleinske kiseline i heteroproteine, koji su vezani za inkluzijsko tijelo i utiču na renaturaciju proteina inkluzijskog tijela. Stoga je pranje prije denaturacije vrlo neophodan korak.

Osim toga, ispiranje inkluzijskih tijela je korisno za povećanje prinosa rekombinantnih proteina. Uklanjanjem nečistoća mogu se smanjiti prepreke u procesu renaturacije, tako da se protein može efikasnije savijati i pravilno sastavljati, čime se poboljšava aktivnost i funkcija proteina‌.

Za pranje se obično koristi manje od 1% neutralnog deterdženta, kao što su Tween, Triton, Urea i NP40 plus EDTA i redukcioni agensi 2-merkaptotreitol (DTT), -merkaptoetanol se ponavlja mnogo puta, jer se kapacitet pranja deterdženta povećava sa povećanje jonske snage rastvora, pri ispiranju inkluzijskih tela može se dodati NaCl za povećanje jonska snaga.

Inkluzijska tijela se mogu koristiti za uklanjanje drugih komponenti otopine za razgradnju stanica centrifugiranjem ili filtracijom, pri čemu oba koriste prednosti različitih fizičkih svojstava inkluzijskih tijela.

 

Centrifugiranje:

Proteini inkluzijskog tijela su mnogo gušći od istog volumena ćelijskih fragmenata, tako da se inkluzijsko tijelo može odvojiti od ostatka ćelije pomoću centrifugiranja. Kontinuirano centrifugiranje je najčešće korištena operacija za dobivanje inkluzijskih tijela u industrijskoj proizvodnji. Budući da je gustina ćelijskih fragmenata manja od gustoće inkluzijskog tijela, brzina sedimentacije je manja od gustoće inkluzijskog tijela. Kontinuirano suspenzija i centrifugiranje mogu centrifugirati veći dio inkluzijskog tijela, dok se ćelijski fragmenti postepeno uklanjaju.
Filtracija (filtracija tangencijalnog protoka) : Zbog različitih molekularnih veličina inkluzijskih tijela i rastvorljivih proteina, može se koristiti metoda filtracije koja može smanjiti operativne troškove i olakšati povećanje. Tangencijalna protočna filtracija (TFF) je vođena razlikom transmembranskog tlaka. Supstance i nečistoće manje od veličine pora membrane prolaze kroz membranu, dok su nečistoće poput ćelija sa većim česticama zarobljene. Otvor membrane koji se općenito koristi za filtracijsko pranje je 0.1μm. Mikrofiltracija sa tangencijalnim protokom šupljih vlakana može se direktno nositi s visokim sadržajem čvrste tvari u tekućem materijalu, manje koraka, jednostavnim radom, membrana se može više puta koristiti kroz čišćenje, smanjujući ulaganje u opremu i operativne troškove, u skladu sa zahtjevima modularne automatizirane proizvodnje.

 

Slijedi primjer primjene za pranje inkluzijskih tijela korištenjem Guidling stubova od šupljih vlakana.

Koristili smo 94cm2 0.1-0.45μm šuplja vlakna da koncentriramo 250mL tečnosti (ciljna molekulska težina proteina 17kd). U cijelom procesu ispiranja istražena je stopa oporavka ciljnog proteina i deplecije membranskog fluksa.

0-71min je proces koncentracije, 71-224min je proces pranja i filtriranja. Tokom cijelog procesa mikrofiltracije, TMP se postepeno povećavao, brzina ulaza tekućine je ostala nepromijenjena, a prosječni tok materijala bio je 12LMH.

Rezultati su pokazali da je ciljni protein bio potpuno zarobljen, a stopa oporavka ciljnog proteina bila je više od 90%. Stubovi od šupljih vlakana za usmjeravanje su stabilni i pogodni za ovu primjenu.

 

Rastvaranje inkluzijskog tijela:

Inkluzijska tijela se općenito otapaju pod uvjetom denaturirajućeg agensa uree ili gvanidin hidrohlorida, a otopljeni proteini inkluzijskog tijela su potpuno denaturirani, odnosno, osim što se zadržava primarna struktura i kovalentne veze, sve vodikove veze i hidrofobne veze su uništene i hidrofobne bočni lanci su potpuno izloženi.

Urea i gvanidin hidrohlorid su denaturanti srednje jačine, koji se lako uklanjaju dijalizom i ultrafiltracijom. Opća koncentracija uree 8-10M, gvanidin hidroklorida 6-8M. Otapanje uree ima prednosti nejonizacije, neutralno, niske cijene, uklanjanje proteina nakon renaturacije neće uzrokovati veliku količinu taloženja proteina, a otopljena inkluzijska tijela mogu se pročistiti raznim hromatografskim metodama, tako da se široko koristi .

 

Ponovno savijanje proteina inkluzijskog tijela:

Otopljeni rekombinantni protein mora biti pravilno presavijen da bi se formirao funkcionalni protein. Tehnike renaturacije uključuju razrjeđivanje proteinske otopine do gotovo neutralne, uklanjanje denaturanta, renaturaciju na koloni i gel filtracijsku hromatografiju. Među njima, razrjeđivanje proteinske otopine do gotovo neutralne i uklanjanje denaturanta je uobičajena klasična metoda renaturacije, posebno metoda renaturacije razblaženjem ima najveću stopu iskorištenja.

Uklanjanje denaturanta:

Dijaliza: Prednost je u tome što se volumen ne povećava, a brzina uklanjanja denaturanta se kontrolira postupnim smanjenjem koncentracije vanjske propusne tekućine, ali traje dugo i lako se formiraju neaktivni proteinski agregati, što nije pogodno za operacije velikih razmera i ne mogu se primeniti na proizvodnu skalu.

Ultrafiltracija (TFF) : lako kontrolirati brzinu dijalize, bilo u istraživanju i razvoju, pilot testiranju ili proizvodnji, može ukloniti denaturanse (promjena tekućine + koncentracija) ultrafiltracijom (TFF).

 

Pročišćavanje proteina inkluzijskog tijela:

Metode prečišćavanja proteina nakon renaturacije su slične onima za prečišćavanje rastvorljivih proteina, naime hromatografija jonske izmene, gel filtraciona hromatografija, afinitetna hromatografija, taloženje soli amonijum sulfata itd.

Inkluzijska tijela nemaju biološku aktivnost, nema potrebe za brigom o gubitku aktivnosti proteina, a velike količine ekspresije neće dovesti do smrti ćelije i maksimizirati otpornost na napad proteaze. Jiuling šuplja vlakna mogu se fleksibilno primijeniti u nizvodnom procesu pročišćavanja inkluzijskih tijela. U koraku pranja inkluzijskog tijela, odlične performanse, u usporedbi s centrifugalnim pranjem, upotreba šupljih vlakana mikrofiltracije s tehnologijom devet godina za pranje tangencijalnog protoka može uvelike skratiti vrijeme procesa, a opća stopa oporavka može doseći više od 90%. Jiuling šuplja vlakna se također mogu koristiti u koraku renaturacije proteina inkluzijskih tijela. Zamućenost napojne tekućine filtrirane šupljim vlaknima mikrofiltracije bit će značajno smanjena, a stopa oporavka proteina je visoka; Upotreba šupljih vlakana ultrafiltracije ne samo da može ukloniti denaturante, već i skratiti vrijeme punjenja hromatografskog uzorka, kako bi se uštedjelo vrijeme, smanjila količina punila i smanjili troškovi proizvodnje. Stopa oporavka mikrofiltracijskih/ultrafiltracijskih šupljih vlakana varira u zavisnosti od materijala, a opća stopa oporavka može doseći 90-95%.

Guidling Technology vas pozdravlja da zatražite testne komplete za srodne recenzije.

 

O Guidlingu

Guidling Technology je nacionalna kompanija visoke tehnologije koja se fokusira na biofarmaceutike, ćelijsku kulturu, prečišćavanje i koncentraciju biomedicine, dijagnostiku i industrijske tekućine. Uspješno smo razvili centrifugalne filter uređaje, ultrafiltracione i mikrofiltracione kasete, virusni filter, TFF sistem, dubinski filter, šuplja vlakna, itd. Koji u potpunosti zadovoljavaju scenarije primjene biofarmaceutika, ćelijske kulture itd. Naše membrane i membranski filteri se široko koriste u koncentraciji, ekstrakciji i odvajanju predfiltracije, mikrofiltracije, ultrafiltracije i nanofiltracije. Naše brojne linije proizvoda, od malih, za jednokratnu upotrebu laboratorijske filtracije do proizvodnih sistema filtracije, testiranja sterilnosti, fermentacije, ćelijske kulture i više, zadovoljavaju potrebe testiranja i proizvodnje. Guidling Technology se raduje saradnji sa vama!