Mjere opreza pri upotrebi ultrafiltracione cijevi
(1) Odaberite odgovarajuću ultrafiltracionu cijev. Generalno, molekularna težina koju treba zadržati ne bi trebala biti veća od 1/3 molekulske težine ciljnog proteina. Na primjer, ako je molekularna težina ciljnog proteina 35 kDa, može se odabrati ultrafiltracijska cijev s molekulskom težinom od 10 kDa. Ako je molekularna težina ciljnog proteina oko 10 kd, može se koristiti ultrafiltracijska cijev s molekulskom težinom od 3KD. Pažljivo pročitajte uputstvo za upotrebu i obratite pažnju na različitu toleranciju ultrafiltracione membrane na različite hemikalije.
(2) Novokupljena ultrafiltracija je suha. Prije upotrebe dodajte ultračistu vodu i voda će u potpunosti proći kroz membranu. Prethodno ga ohladite u ledenoj kupki ili u frižideru nekoliko minuta. Zatim izlijte vodu i dodajte rastvor proteina. Dodata količina ne smije prelaziti bijelu liniju na vrhu epruvete. Operacija bi trebala biti lagana. Prije dodavanja proteinske otopine, ultrafiltracionu cijev treba staviti na led radi prethodnog hlađenja.
(3) Balans. I masa i centar gravitacije trebaju biti izbalansirani. Imajte na umu da brzina i ubrzanje ne bi trebali biti prebrzi, inače će se ultrafiltracijska membrana direktno oštetiti. Započnite centrifugalnu ultrafiltraciju (predhlađenje centrifuge na 4 stepena). Nakon što se broj obrtaja različitih centrifuga pretvori u G, on je drugačiji. Podesite ubrzanje centrifuge na najnižu brzinu kako biste smanjili pritisak na membranu. Imajte na umu da morate pričekati da centrifuga dostigne ciljnu brzinu prije nego što napustite centrifugu, inače kada dođe do problema sa centrifugom, ne možete se nositi s njim u prvi put. Smjer membrane i rotirajuće osovine treba podesiti prema uputama (u slučaju centrifuge s kutnom rotacijom, membrana je okomita na osovinu). U praktičnoj upotrebi, brzina je općenito niža od one u priručniku, što može produžiti vijek trajanja centrifugalne cijevi.
(4) Kada se koncentriše do preostalih 1 ml, uzmite 50 ul puferske otopine i dodajte 10 ul da protiče da vidite da li postaje plavo, kako biste ocijenili da li iz ultrafiltracione cijevi curi protein. Ako epruveta curi, sipajte gornji sloj i protičete kroz novu epruvetu i započnite ultrafiltraciju. Da biste precizno procijenili da li epruveta curi, centrifugirajte sa 5mgml BSA 10 minuta, zatim procijedite, provucite proteinski ljepilo ili Bradford za grubo mjerenje i nastavite dodavati preostali proteinski rastvor za koncentraciju (operirajte na ledu kako biste spriječili da se protein zagrijan) dok se ne dodaju svi koncentrirani rastvori. Obratite pažnju da li tokom centrifugiranja dolazi do taloženja proteina, što dovodi do začepljenja cevi. Ako dođe do precipitacije, odredite specifičan uzrok precipitacije, da li je koncentracija proteina previsoka ili je pufer neodgovarajući; Prvo se može riješiti istovremenom ultrafiltracijom s više ultrafiltracijskih cijevi kako bi se smanjila koncentracija. Ovo posljednje je mijenjanje različitih puferskih otopina dok se protein ne istaloži.
(5) Prethodni koraci se koriste za koncentriranje proteina. Ako želite promijeniti pufer, kada se ukupna otopina proteina koncentrira na oko 1ml, lagano dodajte novi pufer (ultrafiltracija kroz 0.22um ultrafiltracionu membranu), a zatim koncentrirajte na oko 1ml tri puta uzastopno. Konačni volumen posljednje koncentracije ovisi o potrebnoj koncentraciji proteina, koja općenito nije veća od 500ul, ili se može koncentrirati na manje od 200ul. Prema volumnoj koncentraciji od najmanje 10 puta svaki put, može dostići više od 1000 puta tri puta, čime se u osnovi može postići svrha promjene pufera.
