Primjena odUltrafiltracija uExtraction ofNprirodnoColagen

 

Ⅰ.Šta je kolagen

Kolagen je biopolimer, glavna komponenta u vezivnom tkivu životinja, a ujedno i najzastupljeniji i najrasprostranjeniji funkcionalni protein kod sisara, koji čini 25-30% ukupnog proteina, a kod nekih čak i više od 80%. organizmi. Ima ulogu vezivnog tkiva u životinjskim ćelijama.

Prema mjerenju, odrasla osoba ima oko 3 kg kolagena u svom tijelu, koji je uglavnom prisutan u koži, kostima, očima, zubima, tetivama, unutrašnjim organima (uključujući srce, želudac, crijeva i krvne sudove) i drugim dijelovima. ljudskog tela. Njegova funkcija je održavanje morfologije i strukture kože i organa, a također je važna sirovina za popravak oštećenih tkiva.

II. Ekstrakcija kolagena iz ljuske amura ultrafiltracijom

1. Materijali i metode

1.1 Ispitni uzorci

Vodeni ekstrakt sirovog kolagena.

1.2 Metode ispitivanja

1.2.1 Proces ultrafiltracije

1.2.2 Određivanje procesa predfiltracije

U ovom testu optimalni proces predfiltracije se utvrđuje uporednom analizom metode vakuumske filtracije i metode mikrofiltracije. Specifične metode ispitivanja su sljedeće:

① Sirovi vodeni ekstrakt kolagena se filtrira metodom vakuumske filtracije filter papirom kako bi se uklonile suspendirane čestice i nečistoće u vodenom ekstraktu.

② Sirovi vodeni ekstrakt kolagena se filtrira sa 0.2 μm mikrofiltracionom membranom kako bi se uklonile nerastvorljive supstance, nečistoće itd. u vodenom ekstraktu.

1.2.3 Izbor veličine pora ultrafiltracione membrane

Tokom prečišćavanja, veličina pora ultrafiltracione membrane je 100 kDa.

1.2.4 Eksperiment sa jednim faktorom procesa ultrafiltracionog prečišćavanja

Vodeni ekstrakt sirovog kolagena pročišćen je tehnologijom ultrafiltracije. Proučite eksperiment sa jednim faktorom o uticaju radnog pritiska, radne temperature i pH vrednosti na zadržavanje kolagena. Nakon pokretanja opreme za ultrafiltraciju na određeno vrijeme, proučite utjecaj različitih faktora na stopu zadržavanja kolagena.

1.2.5 Formula za izračunavanje

2. Rezultati i analiza

2.1 Analiza procesa prije filtracije

Pogledajte donju tabelu za rezultate poređenja metode vakuumske filtracije i metode mikrofiltracije.

Metoda filtriranja	Koncentracija otopine prije filtriranja/(g/L)	Koncentracija otopine nakon filtriranja/(g/L)	Senzorni fenomeni
metoda vakuumske filtracije	0.45	0.35	Otopina je bistra na kraju filtracije, ali postaje mutna nakon određenog vremenskog perioda.
metoda mikrofiltracije	0.45	0.42	Rastvor je bistar na kraju filtracije i ostaje bistar nakon određenog vremenskog perioda

 

Iz tabele se vidi da i metodom vakuum filtracije i metodom mikrofiltracije mogu se ukloniti nečistoće i nerastvorljive čvrste materije u rastvoru, ali metoda mikrofiltracije ima bolji zaštitni efekat na proteine, odnosno gubitak nije značajan, a metoda vakuumske filtracije može uzrokovati gubitke proteina. Osim toga, filtrat je zamućen nakon određenog vremena postavljanja vakuum filtracijom, dok je mikrofiltracija i dalje bistra i prozirna, pa je mikrofiltracija odabrana kao proces predtretmana ultrafiltracije.

2.2 Jednofaktorski test procesa ultrafiltracije

2.2.1 Utjecaj pritiska ultrafiltracije na stopu zadržavanja

Pod uslovima temperature 40 stepen i pH 9.0, proučite efekte različitih ultrafiltracionih pritisaka (0.07MPa, 0.{101} {11}}9MPa, 0,11MPa, 0,13MPa i 0,15MPa) na stopu zadržavanja proteina. Rezultati su prikazani na donjoj slici.

 

Kao što se vidi iz gornje slike, sa povećanjem radnog pritiska, stopa presretanja proteina postepeno se smanjivala. Na {{0}}.07MPa, stopa zadržavanja proteina je 96,53%, kada je radni pritisak 0,15MPa, stopa zadržavanja proteina je 84,38%. To je zato što je odvajanje tvari ultrafiltracijom vođeno razlikom tlaka. U tom rasponu niskog radnog tlaka, male molekularne tvari mogu brzo proći kroz membranu, ali makromolekularne tvari mogu biti zarobljene ultrafiltracijskom membranom i akumulirati se na površini membrane, a trenutno na površini membrane i vodenom ekstrakt forme koncentracijske razlike da izazove polarizacionu razliku koncentracije; međutim, s povećanjem tlaka, koncentracijski polarizacijski otpor postepeno raste, a razlika koncentracije između površine membrane i vodenog ekstrakta dostiže ravnotežu. Kada pritisak pređe ovu ravnotežu, na površini membrane bi se mogao napisati sloj gela (što je bilo u skladu sa teorijom koncentracijske polarizacije i sloja gela koji se formira tokom ultrafiltracije). Pritisak nastavlja da raste, a debljina sloja gela se povećava, a protein koji ostaje na površini membrane se povećava, što rezultira niskom stopom zadržavanja. Da bi se osigurao efekat razdvajanja membrane, optimalni parametar radnog pritiska je 0,07 MPa.

2.2.2 Utjecaj temperature na brzinu zadržavanja proteina

Pod uslovima pritiska {{0}}.11MPa, pH 9,0, proučavajte uticaje različitih temperatura (25 stepeni, 30 stepeni, 35 stepeni, 40 stepeni i 45 stepeni) na zadržavanje proteina. Rezultati su prikazani na donjoj slici.

 

Kao što je prikazano na gornjoj slici, sa porastom temperature, stopa retencije ultrafiltracione membrane se postepeno povećava, i dostiže maksimum na 45 stepeni, sa stopom zadržavanja od 97,01%. Budući da je viskoznost kolagena usko povezana s temperaturom: kada je temperatura niža, viskoznost kolagena je veća, pa je kolagen lako formirati otpor na površini membrane, što rezultira niskom stopom zadržavanja. Kada se temperatura poveća, viskoznost kolagena se smanjuje i interakcija između molekula kolagena je oslabljena, tako da se brzina prijenosa mase povećava, a polarizacija koncentracije slabi, čime se povećava stopa zadržavanja. Drugi razlog za povećanje stope zadržavanja je taj što se temperatura povećava, a rastvorljivost kolagena se shodno tome povećava i smanjuje se fenomen blokiranja membrane kolagenom. Stoga je optimalna temperatura za ultrafiltraciju 45 stepeni.

2.2.3 Utjecaj pH na zadržavanje proteina

Pod uslovima pritiska {{0}}.11MPa i temperature 40 stepena, proučavajte efekte različitih pH uslova, odnosno pH=6.0, pH{ {5}}.{{10}}, pH=8.0, pH=9.0 i pH=10.0, o stopi zadržavanja . Rezultati su prikazani na donjoj slici.

 

As shown in the above figure, within the pH value range of 6–7, with the increase of pH value, the protein retention rate decreases, and there is a minimum value of 82.13% at pH=7.0. When pH>7, with the increase of pH value, the retention rate gradually increases. This is because the isoelectric point of collagen pH=7, at the isoelectric point of protein is a precipitation state, easy to stay on the surface of the membrane block membrane, so that the retention rate is low; When pH>7, stopa zadržavanja se postepeno povećava s povećanjem pH. To je zato što je ultrafiltraciona membrana membrana od polietera javora s negativnim nabojem, kolagen s negativnim nabojem u alkalnom stanju, negativno nabijene molekule kolagena i ultrafiltraciona membrana sa istim nabojem čine međusobno isključeno stanje, tako da molekulama kolagena nije lako ostati na površini membrane, nije lako blokirati membranu, pa je optimalni pH ultrafiltracije 8-10.

2.3 Optimizacija procesa ultrafiltracije i validacija rezultata

Analiza softvera Design-Expert8.05 pokazuje da su optimalni parametri procesa sljedeći: radni pritisak 0.14MPa, radna temperatura 40.98 stepeni i pH otopine=9.43. Pod ovim uslovima, stopa zadržavanja iznosila je 92,551%. Uzimajući u obzir operativnost stvarnih parametara, radni pritisak je 0,14 MPa, radna temperatura je 40 stepeni, a pH vrednost napojne tečnosti je 9,50 u uslovima ultrafiltracije. Eksperimentalna verifikacija počinje nakon što se sistem uređaja za ultrafiltraciju pokrene da bude stabilan. Dobijeni rezultat stope zadržavanja je (92.61 0.1)% (n=3). Predviđena vrijednost jednačine je u osnovi slična izmjerenoj vrijednosti, što ukazuje da je predviđeni rezultat uslovnog parametra u skladu sa stvarnim uslovnim rezultatom.

2.4 Rezultati analize elektroforeze

Pročišćeni kolagen je analiziran SDS-PAGE elektroforezom, a rezultati su prikazani na donjoj slici.

Kao što je prikazano na gornjoj slici, traka 1 je pročišćeni kolagen u ovom eksperimentu, a traka 2 je standardni uzorak kolagena teleće tetive. Iz SDS-PAGE elektroforeze se moglo vidjeti da bi protein kolagena predložen u ovom eksperimentu mogao biti identificiran kao kolagen, ali naizgled nejasne granice a1 peptidnog lanca i a2 peptidnog lanca nisu jasne. Iz elektroforeze je jasno da nema drugih proteinskih traka, a može se zaključiti da je čistoća pročišćenog kolagena visoka.