Osnovni principi i radni tok sinteze peptida u čvrstoj- fazi (SPPS)
Sinteza peptida u čvrstoj{0}} fazi (SPPS)je metoda za sintezu peptida na čvrstoj podlozi. Glavne SPPS strategije uključujuBoc metodaiFmoc metoda. Sinteza peptida je proces koji se ponavlja uzastopnim dodavanjem aminokiselina i uglavnom se izvodi izC-kraj (karboksilni kraj)to theN{0}}kraj (amino kraj). Prvo, karboksilna grupa prve amino kiseline ciljnog peptida je kovalentno vezana za čvrsti nosač (smolu). Koristeći amino grupu ove aminokiseline kao početnu tačku, uklanja se N-terminalna zaštitna grupa, a rastući peptidni lanac se produžava reakcijom sa viškom aktivirane druge amino kiseline. Ovaj ciklus-spajanje → pranje → uklanjanje zaštite → neutralizacija i pranje → sljedeće spajanje- se ponavlja dok se ne postigne željena dužina peptida. Konačno, peptidni lanac se odvaja od smole i pročišćava da bi se dobio ciljni peptid. Kada je -amino grupa zaštićena saBoc (tert-butiloksikarbonil), metoda se nazivaSinteza peptida u čvrstoj- fazi na bazi Boc-. Kada je -amino grupa zaštićena saFmoc (9-fluorenilmetiloksikarbonil), poznat je kaoFmoc-sinteza peptida u čvrstoj{1}} fazi.
Sinteza peptida u čvrstoj fazi na bazi Boc-a (Boc metoda)
UBoc metoda, Boc grupe koje se mogu ukloniti trifluorosirćetnom kiselinom (TFA)se koriste za zaštitu -amino grupa, dokzaštitne grupe tipa benzil-se koriste za bočne lance. Tokom sinteze, Boc-zaštićena -amino kiselina je prvo kovalentno povezana sa smolom. Boc grupa se zatim uklanja sa TFA, a rezultujući slobodni amino-terminus se neutrališe sa trietilaminom. Sljedeća aminokiselina se aktivira pomoćuDCC (dicikloheksilkarbodiimid)i spojeni da produže peptidni lanac. Nakon završetka sastavljanja, ciljni peptid se odcjepljuje od smole upotrebom jake kiseline, tipičnobezvodni fluorovodonik (HF)ilitrifluorometansulfonska kiselina (TFMSA).U metodi Boc sinteze, potrebni su ponovljeni tretmani kiselinom kako bi se uklonile zaštitne grupe prije svakog koraka spajanja. Ovo može dovesti do nekoliko nuspojava, kao što je prerano cijepanje peptida od smole i nestabilnost bočnih lanaca aminokiselina u kiselim uvjetima, što rezultira neželjenim nuspojavama.
Fmoc{0}}bazirana čvrsta-fazna sinteza peptida (Fmoc metoda)
U1978, Meienhofer i Athertonrazvio strategiju sinteze peptida koristećiFmoc (9-fluorenilmetiloksikarbonil)kao -amino zaštitna grupa, poznata kaoFmoc metoda. U ovom pristupu, -amino grupa je zaštićena sabazni{0}}labilni Fmoc, dok su bočni lanci zaštićeni sazaštitne grupe -labilne Boc{1}} vrste.Glavna prednost Fmoc-a kao amino-zaštitne grupe je njegovastabilnost u kiselim uslovima; na njega ne utiče tretman reagensima kao nprtrifluorosirćetna kiselina (TFA)i može se selektivno ukloniti pomoćublaga baza. Istovremeno, zaštitne grupe bočnih{1}}lanca kao što je Boc su stabilne u baznim uslovima i uklanjaju se kiselom obradom. Konačno, peptid se kvantitativno odvaja od smole pomoćuTFA/diklorometan (DCM), izbjegavajući upotrebu jakih kiselina i time poboljšavajući sigurnost i kompatibilnost s rutinskom sintezom peptida.
Istorija razvoja čvrste{0}}fazne peptidne sinteze (SPPS)
1. Temeljna faza (početak 20. vijeka do 1963.)
U1902, Emil Fischerbio je prvi koji je istraživao sintezu peptida, ali je napredak bio spor zbog tehničkih ograničenja. Primijenjene rane sintezebenzoil i acetil zaštitne grupe, koje je bilo teško ukloniti i često su dovodile do togacepanje peptidnog lanca.
U1932, Max Bergmanni{0}}radnici su predstavilibenziloksikarbonil (Z) grupakao -amino zaštitna grupa. Ova grupa se može ukloniti podkatalitička hidrogenacija ili kiseli uslovi, pružajući pouzdaniji alat za sintezu peptida i postavljajući temelje za razvoj sinteze peptida u čvrstoj{0}} fazi 1960-ih.
Tokom1950s, naučnici su uspješno sintetizirali raznebiološki aktivni peptidi, kao što jeoksitocin i insulin. Ova dostignuća su dodatno unaprijedila hemiju peptida i postavila temelje za pojavu sinteze peptida u čvrstoj{1}}fazi.
2. Pionirska pozornica (1963.)
U1963, Robert B. Merrifieldpredložio jemetoda sinteze peptida u čvrstoj{0}} fazi (SPPS)., u kojem jeC{0}}terminalna aminokiselinaje usidren za smolni nosač, a peptidni lanac se izdužuje kroz ponovljene cikluseuklanjanje zaštite i spajanje. Ovaj pristup je uvelike pojednostavio proces sinteze peptida i postaopreferirani metodza sklapanje peptida.
Merrifield korištenBoc (tert-butiloksikarbonil)za zaštitu -amino grupe. Do kasnih 1960-ih, on je također razvioprvi potpuno automatizovani sintetizator peptidai uspješno sintetiziranabioloških proteinakao što jeribonukleaza (124 aminokiseline). Za ova revolucionarna dostignuća, Merrifield je nagrađenNobelova nagrada za hemiju 1984.
3. Faza tehnološke inovacije (1972.)
U1972, Lou Carpinorazvio9-fluorenilmetiloksikarbonil (Fmoc) zaštitna grupa, što može bitinježno uklonjen pod osnovnim uvjetima, smanjujući nuspojave. To ga je učinilo posebno pogodnim zakompleksni peptidiiautomatizovana sinteza.
TheFmoc metodapostepeno zamijenio Boc metod kao glavnu strategiju. Automatski peptidni sintetizatori bazirani na obaFmoc i Boc hemijasu naknadno razvijeni, pokretajućiautomatizacija sinteze peptidai značajno poboljšava efikasnost i ponovljivost.
4. Faza zrelosti i ekspanzije (od 1990-ih do danas)
Optimizacija smole i reagensa:Razvoj ofvisoko{0}}opterećene, hidrofilne PEG-modificirane smolei efikasni reagensi za spajanje kao nprHBTUiHATUznačajno je poboljšao efikasnost i prinos sinteze peptida u čvrstoj{0}} fazi (SPPS).
Tehnološka integracija:Novi pristupi poputmikrovalna{0}}potpomognuta sintezaiprotočna hemijaimaju skraćeno vrijeme reakcije i dodatno povećane prinose.
Osnovni principi i tok rada SPPS-a:
Osnovni princip sinteze peptida u čvrstoj{0}}fazi jepostupna konstrukcija peptidnog lanca na čvrstoj podlozi, koristećistrategije zaštite grupeireakcije kondenzacije (spajanja).postićiefikasan i kontrolisan sklop peptida.
1. Uloga čvrste podloge (smole) u sintezi peptida u čvrstoj- fazi (SPPS)
A nerastvorljiva polimerna smola-kao što jepolistiren-divinilbenzen unakrsno-povezana smola, Wang smola ili Rink amidna smola-je odabrano kao solidna podrška u SPPS-u. Površina smole sadržifunkcionalne grupe(npr. hidroksilne ili amino grupe) koje se mogu formiratikovalentne veze sa jednim krajem peptidnog lanca, običnoC{0}}terminus, sidrenje peptida na čvrstu podlogu. Ovaj kovalentni spoj osigurava da rastući peptidostaje vezan za smolu tokom cijele sinteze, što uvelikeolakšava naknadne korake reakcije, pranje i prečišćavanje
2.Zaštita grupne strategije u sintezi peptida u čvrstoj- fazi (SPPS)
Tokom sinteze peptida,-amino grupa, karboksilna grupa i funkcionalne grupe reaktivnog bočnog-lancaaminokiselina (kao što su tiol, karboksil i amino grupe) su skloninuspojave. Kako biste spriječili ove neželjene reakcije,zaštitne grupese koriste. Uobičajene zaštitne grupe uključuju:-Grupe za zaštitu aminokiselina:
Boc (tert-butiloksikarbonil):Kiselina{0}}labilna, lako se uklanja ispodkiseli uslovi.
Fmoc (9-fluorenilmetiloksikarbonil):Stabilan u kiselim uslovima, može se ukloniti podosnovni uslovi(npr. rastvor piperidina/DMF).{0}}Grupe za zaštitu bočnog lanca:Odabrano prema hemijskim svojstvima bočnog lanca aminokiselina. Uobičajene grupe uključujubenzil (Bn), tert-butil (tBu), tritil (Trt), itd. Ove grupe suuklanja se na kraju sinteze, obično tokom cijepanja peptida od smole, upotrebomkiseline ili drugih specifičnih stanja.
3.C-Terminus to N-Terminus Synthesis u SPPS
Učvrsta{0}}fazna sinteza peptida (SPPS), sklapanje peptida obično počinje uC-kraj (karboksilni kraj)i nastavlja korak po korak premaN{0}}kraj (amino kraj). To je zato štoC-terminalna aminokiselina se prvo vezuje za čvrsti nosač, a naknadne aminokiseline su spojene naslobodna amino grupa peptidnog lanca već vezana za smolu, postepeno produžavajući peptidni lanac.
4.Reakcija spajanja u sintezi peptida u čvrstoj- fazi (SPPS)
Zaštićene aminokiseline moraju bitiaktivirantako da njihovkarboksilne grupe postaju reaktivne, omogućavajući im da formiraju apeptidnu vezusa amino grupom peptida vezanog za smolu{0}}. Commonreagensi za aktiviranjeuključitikarbodiimidi(npr. DCC, DIC),HOBt, HATU, iPyBOP. Jednom aktivirana, karboksilna grupa reaguje sa slobodnom amino grupom u areakcija kondenzacije, formirajući anamidna vezai time vezuje novu aminokiselinu na rastući peptidni lanac.
5. Ponavljajuće (ciklične) operacije u čvrstoj-fazi sinteze peptida (SPPS)
Proces uključujeponavljanje ciklusa uklanjanja zaštite → spajanja → pranja, dodajućijedna aminokiselina po ciklusukako bi se postepeno produžio peptidni lanac. Nakon svakereakcija spajanja, smola jeoprano(npr. sa rastvaračima kao što su DMF ili DCM) za uklanjanje neizreagiranih reagensa, nusproizvoda-i viška aminokiselina. The-amino grupa novododatog ostatka se tada uklanja, izlažući slobodni amin da se pripremi za sljedeću reakciju spajanja. Ovaj ciklus se ponavlja sve dok se željena peptidna sekvenca potpuno ne sastavi.
6. Cijepanje u čvrstoj-fazi peptidne sinteze (SPPS)
Jednom kada peptidni lanac dostigne željenu dužinu, jesteodcijepljen od čvrstog nosačakoristeći odgovarajući reagens, a istovremenouklanjanje svih zaštitnih grupa. Uobičajeni reagens za cijepanje jetrifluorosirćetna kiselina (TFA), što ne samorazbija vezu između peptida i smoleali isto takouklanja zaštitne grupekao što su Fmoc i Boc, vraćajući peptid u njegovo stanjerodna država. Jednom kada peptidni lanac dostigne željenu dužinu, jesteodcijepljen od čvrstog nosačakoristeći odgovarajući reagens, a istovremenouklanjanje svih zaštitnih grupa. Uobičajeni reagens za cijepanje jetrifluorosirćetna kiselina (TFA), što ne samorazbija vezu između peptida i smoleali isto takouklanja zaštitne grupekao što su Fmoc i Boc, vraćajući peptid u njegovo stanjerodna država.
Kroz ove korake,čvrsta{0}}fazna sinteza peptida (SPPS)omogućavaefikasno i kontrolisano sklapanje peptidnih lanaca na čvrstoj podlozi, izbjegavajući komplikovane međukorake prečišćavanja koji su potrebni u tradicionalnoj sintezi{0}}fazne faze i značajnopoboljšanje efikasnosti sinteze i prinosa.
Kroz ove korake,čvrsta{0}}fazna sinteza peptida (SPPS)omogućavaefikasno i kontrolisano sklapanje peptidnih lanaca na čvrstoj podlozi, izbjegavajući komplikovane međukorake prečišćavanja koji su potrebni u tradicionalnoj sintezi{0}}fazne faze i značajnopoboljšanje efikasnosti sinteze i prinosa.
